METTL3在ESCC中的表达及临床相关性分析
验证METTL3在ESCC中是否高表达并与患者生存相关
分析TCGA和GSE53625数据集、119对ESCC标本的基因表达谱、81对ESCC组织芯片的IHC染色，以及9种ESCC细胞系和Het-1a细胞的METTL3表达；Kaplan-Meier分析生存。
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METTL3通过APC mRNA N6-甲基腺苷依赖性YTHDF结合介导的APC表达降低促进肿瘤发展
METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding.
实验完整度
高包含细胞系、患者样本、小鼠移植瘤模型，并有MeRIP-seq、RIP、荧光素酶报告基因等功能与机制验证
主要模型
ESCC细胞系KYSE180和KYSE450 人ESCC组织及癌旁正常组织 裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
METTL3敲低或过表达后APC mRNA m6A水平变化（MeRIP-qPCR） YTHDF2与APC mRNA结合及YTHDF2敲低对APC表达的影响 APC m6A位点突变对荧光素酶活性的影响 METTL3敲低联合APC敲低对小鼠移植瘤生长的影响 TCGA和GSE53625数据集中METTL3与APC表达相关性
摘要
腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）是癌症中频繁突变的肿瘤抑制基因。然而，APC是否在表观转录组水平受到调控仍不清楚。在本研究中，我们分析了TCGA数据并分离了200对食管鳞状细胞癌（ESCC）标本及其癌旁正常组织，证明甲基转移酶样3（METTL3）在肿瘤组织中高表达。m6A-RNA免疫沉淀测序显示METTL3上调APC的m6A修饰，从而招募YTHDF导致APC mRNA降解。APC表达降低增加了β-catenin以及β-catenin介导的cyclin D1、c-Myc和PKM2表达，从而导致有氧糖酵解增强、ESCC细胞增殖和小鼠肿瘤形成。此外，APC表达下调与人类ESCC标本中METTL3表达上调及ESCC患者不良预后相关。我们的发现揭示了ESCC中Wnt/β-catenin通路通过METTL3/YTHDF偶联的表观转录组下调APC而上调的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- APC是否在表观转录组水平受到调控并因此促进肿瘤发展？
- 核心机制
- METTL3上调APC mRNA的m6A修饰，招募YTHDF2导致APC mRNA降解，降低APC表达，进而稳定β-catenin并激活其下游cyclin D1、c-Myc和PKM2表达。
- 主要证据
- MeRIP-seq和MeRIP-qPCR显示METTL3调控APC mRNA m6A；RIP显示YTHDF2结合APC mRNA；荧光素酶报告基因验证m6A位点功能；细胞增殖、克隆形成、糖酵解测定和小鼠移植瘤实验证实功能；人ESCC标本中METTL3与APC表达负相关。
- 研究意义
- 揭示了ESCC中Wnt/β-catenin通路通过METTL3/YTHDF偶联的表观转录组下调APC而上调的机制，可能为ESCC患者治疗提供有前景的途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
METTL3对ESCC细胞增殖和体内肿瘤生长的作用
验证METTL3是否促进ESCC细胞增殖和肿瘤生长
在KYSE180和KYSE450细胞中敲低或过表达METTL3（包括Tet-on诱导和活性突变体），进行细胞增殖和克隆形成实验；将细胞皮下注射到裸鼠，测量肿瘤大小、体积和重量。
METTL3调控APC mRNA m6A修饰的鉴定
验证METTL3是否结合并上调APC mRNA的m6A水平
METTL3敲低后测定总RNA m6A含量，MeRIP-seq鉴定m6A峰和基序，MeRIP-qPCR检测APC mRNA m6A水平，RIP检测METTL3与APC mRNA结合。
m6A修饰对APC表达的影响及YTHDF2的作用
验证METTL3介导的m6A是否抑制APC表达并依赖YTHDF2
构建含WT或突变m6A位点的APC荧光素酶报告基因，检测METTL3敲低/过表达和YTHDF2敲低对荧光素酶活性的影响；qPCR和免疫印迹检测APC表达；RIP检测YTHDF1-3与APC mRNA结合。
METTL3-APC轴对β-catenin下游基因、糖酵解和细胞增殖的调控
验证APC下调是否介导METTL3对β-catenin信号、糖酵解和细胞增殖的促进作用
METTL3敲低联合APC敲低，检测β-catenin、cyclin D1、c-Myc、PKM2表达，葡萄糖消耗和乳酸生成，细胞增殖和克隆形成，以及13C6葡萄糖代谢流分析。
METTL3通过抑制APC促进体内肿瘤生长的验证
验证METTL3对肿瘤生长的促进作用是否依赖于APC抑制
将METTL3敲低或联合APC敲低的KYSE180和KYSE450细胞皮下注射到裸鼠，测量肿瘤大小、体积、重量和肿瘤组织乳酸含量，并进行IHC检测APC、β-catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2表达。
人ESCC标本中METTL3与APC表达的相关性分析
验证METTL3与APC表达在临床标本中的负相关及预后意义
TCGA数据分析METTL3与APC mRNA相关性；GSE53625数据集分析APC表达；81例ESCC标本IHC检测METTL3、APC和β-catenin表达及相关性；Kaplan-Meier分析APC表达与生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 |
| 免疫组织化学和免疫印迹 | β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 |
| 免疫印迹 | METTL3抗体 | Cell Signaling Technology | 86132 |
| METTL14抗体 | Cell Signaling Technology | 51104 | |
| 免疫组织化学 | 抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 8114 |
| 免疫印迹 | cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 55506 |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| α-Tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| 免疫组织化学和RIP | METTL3抗体 | Abcam | ab195352 |
| 免疫组织化学 | APC抗体 | Abcam | ab15270 |
| 免疫印迹 | APC抗体 | Abcam | ab154906 |
| c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| RIP和免疫印迹 | YTHDF1抗体 | Proteintech | 17479-1-AP |
| YTHDF2抗体 | Proteintech | 24744-1-AP | |
| YTHDF3抗体 | Proteintech | 25537-1-AP | |
| MeRIP-seq | 抗m6A多克隆抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| 细胞裂解 | RIPA裂解提取缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89901 |
| 免疫组织化学 | 氯化硝基四氮唑蓝 | MedChem Express | HY-15925 |
| 代谢流分析 | D-葡萄糖13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-PCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- |
| m6A定量 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | P-9005 |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| Tet-on诱导 | 四环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒8 | Dojindo | -- |
| 葡萄糖消耗测定 | 葡萄糖比色测定试剂盒 | BioVision | K606 |
| 乳酸生成测定 | 乳酸比色测定试剂盒 | BioVision | K627 |
| RIP实验 | Magna RIP试剂盒 | Millipore | 17-700 |
| MeRIP-qPCR | Magna MeRIP m6A试剂盒 | Millipore | 17-10499 |
| miRNeasy试剂盒 | QIAGEN | 217004 | |
| GenElute mRNA小量制备试剂盒 | Sigma-Aldrich | MRN10 | |
| MeRIP-seq | NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| 蛋白A磁珠 | Thermo Fisher | -- | |
| m6A | Berry & Associates | PR3732 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（RPMI-1640+10%FBS+1%双抗）、四环素浓度（1 μg/ml和2 μg/ml） 阅读提示：Methods中Cell culture和Lentivirus production and infection小节 |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c nude，雌性，4-5周龄）、细胞接种量（1×10^6）、注射部位（侧腹）、每组小鼠数（n=6）、测量时间（5或6周） 阅读提示：Methods中Animal experiments小节 |
| MeRIP-seq与MeRIP-qPCR | 抗体（Synaptic Systems 202003，Millipore 17-10499）、m6A peak fold-change阈值（>2）、测序平台（Illumina HiSeq 4000） 阅读提示：Methods中m6A-RIP and m6A sequencing和MeRIP quantitative PCR小节 |
| RIP实验 | 抗体稀释比例（1:50）、kit（Millipore 17-700）、细胞系（KYSE180和KYSE450） 阅读提示：Methods中RIP assays小节 |
| 荧光素酶报告基因实验 | APC最后外显子WT或突变m6A序列、细胞系（HEK 293T）、转染试剂（Lipofectamine 3000） 阅读提示：Methods中Dual-luciferase reporter assays小节 |
| 糖酵解测定 | 葡萄糖和乳酸检测试剂盒（BioVision K606和K627）、细胞汇合度（50%）、孵育时间（12-24小时） 阅读提示：Methods中Measurements of glucose consumption and lactate production小节 |