鉴定METTL14精氨酸甲基化位点
确定METTL14是否存在精氨酸甲基化及其具体位点。
在HeLa细胞中表达SFB-METTL14，免疫沉淀后检测精氨酸甲基化，并用LC-MS/MS鉴定修饰位点。
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METTL14的精氨酸甲基化促进RNA N6-甲基腺苷修饰和小鼠胚胎干细胞的内胚层分化
Arginine methylation of METTL14 promotes RNA N6-methyladenosine modification and endoderm differentiation of mouse embryonic stem cells.
实验完整度
高包含体外细胞系、mESC突变模型、分子模拟、组学及功能分化验证。
主要模型
HeLa细胞系 E14Tg2a小鼠胚胎干细胞（mESCs） METTL14 R255K敲入mESC PRMT1敲除mESC
重点核对
METTL14 R255K突变降低mRNA m6A水平（LC-MS/MS和斑点印迹） PRMT1与METTL14相互作用并甲基化R255（Co-IP和体外甲基化实验） R255me增强METTL3/METTL14与WTAP结合及RNA结合能力（Co-IP和RNA pull-down） R255K影响mESC内胚层分化（EB分化和定向分化） PRMT1敲除降低mRNA m6A且过表达PRMT1不能挽救R255K细胞的m6A下降
摘要
RNA N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA中最丰富的内部修饰，在人类发育和健康中发挥关键作用。蛋白质的翻译后甲基化通常对酶活性的动态调节至关重要。然而，核心甲基转移酶METTL3/METTL14的甲基化在m6A调控中的作用仍不清楚。我们通过质谱发现METTL14的精氨酸255（R255）被甲基化（R255me）。在METTL14 R255K突变的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，整体mRNA m6A水平大幅降低。我们进一步发现R255me极大地增强了METTL3/METTL14与WTAP的相互作用，并促进该复合物与底物RNA的结合。我们显示蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1（PRMT1）与METTL14相互作用并在R255处甲基化METTL14，与此一致，PRMT1的缺失整体上减少了mRNA m6A修饰。最后，我们发现R255me的缺失优先影响mESCs的内胚层分化。综上所述，我们的发现表明METTL14的精氨酸甲基化稳定了m6A甲基转移酶复合物与底物RNA的结合，从而促进整体m6A修饰和mESC内胚层分化。这项工作突出了基因表达中蛋白质甲基化与RNA甲基化之间的交叉调控。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- METTL14的精氨酸甲基化是否调控m6A甲基转移酶复合物活性及小鼠胚胎干细胞分化？
- 核心机制
- PRMT1甲基化METTL14 R255，增强METTL3/METTL14与WTAP的相互作用及与底物RNA的结合，从而促进整体m6A修饰。
- 主要证据
- 在HeLa和mESCs中通过质谱鉴定R255me，R255K突变降低m6A水平，PRMT1相互作用并甲基化METTL14，R255K削弱WTAP结合和RNA结合，并影响内胚层分化标志物表达。
- 研究意义
- 揭示了蛋白质精氨酸甲基化与RNA m6A修饰之间的交叉调控，及其在mESC内胚层分化中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证R255甲基化对m6A水平的影响
探究METTL14 R255K突变对mRNA m6A修饰的影响。
利用CRISPR-Cas9构建METTL14 R255K敲入mESC，检测m6A水平及MeRIP-seq。
确定PRMT1对METTL14 R255的甲基化
验证PRMT1是否与METTL14相互作用并甲基化R255。
通过TAP pull-down和Co-IP检测相互作用，体外甲基化实验验证PRMT1甲基化R255。
探究R255me对甲基转移酶复合物与RNA结合的影响
阐明R255me调控m6A修饰的分子机制。
检测METTL14与METTL3/WTAP的相互作用，RNA pull-down和PAR-CLIP-qPCR评估RNA结合能力，分子模拟分析结合稳定性。
评估R255me对mESC内胚层分化的影响
研究R255甲基化在mESC分化中的生物学功能。
通过EB分化和定向内胚层分化诱导，检测分化标志物表达和mRNA稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白质相互作用
分析RNA结合与稳定性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | -- | |
| 谷氨酰胺 | Invitrogen | -- | |
| 1-硫代甘油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| 明胶 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Polyscience | -- | |
| 嘌呤霉素 | ThermoFisher | -- | |
| 博来霉素 | ThermoFisher | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | -- |
| TAP纯化 | 链霉亲和素琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- |
| S蛋白珠 | Novagen | -- | |
| 生物素 | Sigma | -- | |
| Western blot | Dylight 800山羊抗兔IgG | Abbkine | A23920 |
| Dylight 800山羊抗小鼠IgG | Abbkine | A23910 | |
| 小鼠抗WTAP抗体 | Proteintech | 60188-1-Ig | |
| 兔抗WTAP抗体 | Abcam | ab195380 | |
| 兔抗METTL3抗体 | Bethyl | A301-567A | |
| 兔抗METTL14抗体 | Sigma | HPA038002 | |
| 兔抗PRMT1抗体 | CST | 2449 | |
| 小鼠抗单甲基和二甲基精氨酸抗体 | Abcam | ab412 | |
| 兔抗单甲基精氨酸抗体 | CST | 8015S | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 小鼠抗flag抗体 | MBL | M185-3L | |
| 小鼠抗MYC抗体 | MBL | M192-3 | |
| 小鼠抗HA抗体 | MBL | M180-3 | |
| 抗小鼠二抗 | KPL | 5220-0341 | |
| 抗兔二抗 | KPL | 5220-0336 | |
| VeriBlot IP检测试剂（HRP） | Abcam | ab131366 | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads蛋白G（A1） | Invitrogen | 10004D |
| 对照兔IgG | Santa | SC-2027 | |
| 体外甲基化实验 | TCEP | ThermoFisher | 20490 |
| m6A斑点印迹 | m6A抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| Amersham Hybond-N+膜 | GE Healthcare | -- | |
| 抗兔IgG-HRP | KPL | 5220-0336 | |
| m6A定量 | 核酸酶P1 | Sigma | N8630 |
| 小牛肠碱性磷酸酶 | Takara | 2250A | |
| PAR-CLIP | 4-硫尿苷 | Aladdin | -- |
| RNase T1 | ThermoFisher | -- | |
| flag珠 | Genscript | -- | |
| MeRIP-seq | m6A抗体 | Abcam | ab151230 |
| N6-甲基腺苷 | Selleckchem | -- | |
| Epicentre Ribo-zero rRNA去除试剂盒 | Epicentre | -- | |
| NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（用于Illumina） | New England Biolabs | -- | |
| RNA提取 | TRNZOL | TIANGEN | -- |
| mRNA纯化 | Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | ThermoFisher | 61006 |
| 逆转录 | GoScript逆转录系统 | Promega | A500 |
| 细胞分化 | 激活素A | R&D | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | R&D | -- | |
| 1-硫代甘油 | Sigma | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 碱性磷酸酶染色 | BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | -- |
| 碱性磷酸酶定量 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA pull-down | MyOne链霉亲和素C1珠 | ThermoFisher | -- |
| 含m6A基序的RNA探针 | Takara | -- | |
| RNase抑制剂 | Promega | -- | |
| 细胞组分分离 | PhosSTOP片剂 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | mESC培养条件：高糖DMEM+15% FBS+NEAA+谷氨酰胺+1-硫代甘油+青霉素/链霉素+1000 U/mL LIF；EB分化：无LIF悬浮培养，密度1×10^5/mL；定向内胚层分化：activin A 50 ng/ml，bFGF 5 ng/ml处理48 h 阅读提示：Methods: Cell cultures |
| R255K敲入细胞系构建 | sgRNA设计、供体载体构建、电穿孔转染、嘌呤霉素筛选浓度2 μg/mL、单克隆鉴定 阅读提示：Methods: Generation of knock-in and knockout cell lines |
| AdOx处理 | AdOx浓度30 μM，处理时间36 h，DMSO对照 阅读提示：Methods: Inhibitor treatment |
| m6A斑点印迹与LC-MS/MS | mRNA纯化方法、m6A抗体浓度（斑点印迹1:3000）、LC-MS/MS样品制备 阅读提示：Methods: m6A dot blots; Quantification of RNA m6A by LC–MS/MS |
| PAR-CLIP-qPCR | 4SU浓度100 μM，doxycycline 6 μg/ml，UV交联400 mJ/cm2，RNaseT1 1 U/μL处理8 min 阅读提示：Methods: Photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation qPCR |