单细胞期胚胎tomo-seq空间转录组
以高空间分辨率测量单细胞期斑马鱼胚胎沿动物-植物极轴的mRNA空间分布。
将受精后约30 min的单细胞期胚胎沿动物-植物极轴包埋，切成96片（10 µm），加入ERCC spike-in后提取RNA，经带空间条形码的poly-dT引物逆转录、IVT扩增和建库测序，共3个独立样本。
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早期斑马鱼胚胎中的时空mRNA追踪
Spatio-temporal mRNA tracking in the early zebrafish embryo.
实验完整度
高含体外细胞系、单细胞期胚胎tomo-seq、scSLAM-seq单细胞标记追踪、整胚原位杂交验证及两种爪蟾卵母细胞空间转录组
主要模型
单细胞期斑马鱼胚胎 原肠胚期斑马鱼单细胞 X. laevis与X. tropicalis卵母细胞 Flp-In 293细胞
重点核对
tomo-seq将单细胞期胚胎沿动物-植物极轴切成96片（10 µm），3个独立样本 97个植物极定位基因经整胚原位杂交验证7个基因及动物极基因exd2 4sUTP注射（4 nl，12.5 mM）后于shield期解离10个胚胎，10× Genomics测序7472个细胞 scSLAM-seq标记效率约5%，未标记合子转录本假阴性率约1% 植物极基因在PGCs中显著富集（p=4.67×10⁻⁵），28个为PGC簇标记基因
摘要
胚胎发生的早期阶段依赖于母源mRNA的亚细胞定位和运输。然而，单细胞RNA测序缺乏时空信息，阻碍了对这些过程的系统分析。在此，我们结合空间分辨转录组学和单细胞RNA标记，对早期斑马鱼发育过程中的转录组进行时空分析。我们测量了单细胞期胚胎内mRNA分子的空间定位，从而鉴定出一类特异定位于胚外位置——植物极的mRNA。此外，我们建立了一种在早期斑马鱼胚胎中进行高通量单细胞RNA标记的方法，使我们能够追踪单个母源转录本直至原肠胚形成的命运。该方法揭示许多定位转录本被特异性地运输到原始生殖细胞。最后，我们获取了两个爪蟾物种的空间转录组，并比较了定位基因的进化保守性以及富集的序列基序。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在全转录组和单细胞水平系统分析早期斑马鱼胚胎母源mRNA的亚细胞定位、运输及其对细胞命运的贡献。
- 核心机制
- 母源mRNA通过3′UTR顺式调控元件定位于植物极，随后被特异性运输至原始生殖细胞（PGCs），参与生殖细胞特化。
- 主要证据
- 改进的tomo-seq在单细胞期胚胎中鉴定97个植物极定位基因并经整胚原位杂交验证；scSLAM-seq追踪母源转录本至原肠胚，发现植物极基因在PGCs中显著富集；三物种3′UTR k-mer富集分析显示CAC核心、GUU基序和polyU序列保守。
- 研究意义
- 建立了斑马鱼胚胎高通量单细胞RNA标记和亚细胞分辨率空间转录组方法，提供三种脊椎动物定位基因的全转录组资源，并提出PGC特化是植物极定位基因的主要功能之一。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于SOM的mRNA定位模式系统鉴定
系统分类基因的空间表达模式并鉴定植物极定位基因。
对tomo-seq数据进行SOM聚类（50个profile），比较三个重复，定义植物极定位基因标准并用整胚原位杂交验证候选基因。
早期斑马鱼胚胎单细胞RNA标记（scSLAM-seq）
在单细胞水平区分母源与合子转录本并追踪母源转录本命运。
受精后注射4sUTP，50%外包期去绒毛膜，shield期解离10个胚胎，甲醇固定后在完整细胞中用IAA化学转化，10× Genomics Chromium测序并用自定义代码分析。
母源植物极转录本在细胞类型中的命运追踪
确定植物极定位母源转录本在原肠胚期富集于哪些细胞类型。
在6 h.p.f.检测97个植物极基因中91个的未标记RNA，过滤低表达后对47个基因计算各细胞类型相对其他细胞的表达倍数变化，并用CellChat和CellPhoneDB分析配体-受体相互作用。
爪蟾卵母细胞空间转录组与跨物种比较
比较斑马鱼与爪蟾植物极mRNA定位的进化保守性及3′UTR序列基序。
对X. tropicalis和X. laevis成熟卵母细胞进行tomo-seq（每种两个重复），SOM聚类鉴定定位基因，比较三物种重叠并进行3′UTR k-mer富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| tomo-seq RNA提取 | ERCC外源对照RNA | -- | -- |
| Glycoblue核酸共沉淀剂 | -- | -- | |
| tomo-seq逆转录 | SuperScript II逆转录酶 | -- | -- |
| tomo-seq第二链合成 | SuperScript III逆转录酶 | -- | -- |
| bulk RNA测序建库 | Illumina TruSeq链特异性mRNA建库试剂盒 | Illumina | -- |
| bulk RNA测序 | Illumina HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- |
| scSLAM-seq 4sUTP注射 | 4-硫代尿苷三磷酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| Tris·HCl pH 7.4 | Carl Roth | -- | |
| scSLAM-seq细胞固定 | 甲醇 | Carl Roth | -- |
| scSLAM-seq细胞解离 | HBSS缓冲液 | Life Technologies | -- |
| scSLAM-seq淬灭 | DPBS缓冲液 | Gibco | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNaseOUT核糖核酸酶抑制剂 | Life Technologies | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Carl Roth | -- | |
| scSLAM-seq测序 | 10x Chromium单细胞3′试剂盒（V2和V3） | 10x Genomics | -- |
| Illumina NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| 斑点印迹检测4sUTP掺入 | MTSEA-XX-生物素 | Biotium | -- |
| 相分离凝胶管 | Quantabio | -- | |
| Hyperbond N+膜 | Amersham | -- | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Pierce | -- | |
| Amersham ECL蛋白印迹检测试剂 | GE Healthcare | -- | |
| 阳性对照细胞培养 | Flp-In 293细胞 | Thermo Fisher | R75007 |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞期胚胎tomo-seq | 胚胎取材时间（受精后约30 min）、切片厚度10 µm、每样本96片、3个独立样本、ERCC稀释比例1:50,000 阅读提示：Methods中Tomo-seq小节及Fig. 1a图注 |
| 植物极定位基因判定 | SOM profile数50、判定阈值（所有重复profile 46–50且至少一个重复48–50）、低表达基因过滤标准 阅读提示：Methods中Further processing of tomo-seq data小节及Fig. 2a、Supplementary Fig. 2 |
| 4sUTP注射与标记 | 注射量4 nl、浓度12.5 mM、溶剂10 mM Tris·HCl pH 7.4、注射时间（受精后立即） 阅读提示：Methods中4sUTP injections小节及Fig. 3a图注 |
| 细胞固定与IAA转化 | 甲醇终浓度80%、固定温度−20 °C与时间30 min、IAA终浓度10 mM、转化室温避光过夜 阅读提示：Methods中Cell fixation and iodoacetamide treatment小节 |
| scRNA-seq上样与数据分析 | 每样本10个shield期胚胎、35 µm滤网、10× Genomics 3′ kit V2/V3、7472个细胞、T-to-C突变判定标准（每UMI>1突变，碱基质量>20） 阅读提示：Methods中Rehydration and preparation for scRNA-seq及scSLAM-seq mapping and analysis小节 |
| 爪蟾卵母细胞tomo-seq | 物种（X. tropicalis、X. laevis）、每物种两个重复、切片分辨率（10 µm；16和18 µm）、卵母细胞来源 阅读提示：Methods中Preparation of frog oocytes及Tomo-seq小节、Fig. 5a图注 |