建立创伤诱导毛囊新生模型并观察毛囊再生
确认实验室小鼠与非洲刺鼠创面可发生新生毛囊并比较空间分布。
在C57BL/6小鼠背部制作全层创面，非洲刺鼠制作全层创面，观察PWD28新生毛囊并行AP染色与K15全mount免疫染色。
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实验室小鼠与非洲刺鼠创伤诱导毛囊再生中组织力学的对称性破缺
Symmetry breaking of tissue mechanics in wound induced hair follicle regeneration of laboratory and spiny mice.
实验完整度
高含体外/离体AFM与SHG检测、RNA-seq、转基因小鼠、慢病毒过表达及多物种在体创面模型，并有功能与机制验证
主要模型
C57BL/6J小鼠全层皮肤创面WIHN模型 K14-Cre-Twist1转基因小鼠创面模型 非洲刺鼠Acomys cahirinus全层皮肤创面模型 小鼠创面表皮与真皮组织样本
重点核对
C57BL/6小鼠1×1 cm全厚度创面，非洲刺鼠1.5×1.5 cm全厚度创面 Blebbistatin 100 μM自PWD10至PWD16每日20 μl处理创面 Harmine与GM6001溶解于DMSO，PWD10至PWD16每日处理 RNA-seq比较PWD14创面中心与边缘表皮，DEG阈值p或FDR<0.05 AFM在32 °C、最大压痕力5 nN、速率1 μm/s下测定硬度
摘要
组织再生是重建并恢复器官结构与功能的过程。尽管既往研究已在实验室小鼠（Mus）中证实创伤诱导毛囊新生（WIHN），但其再生仅局限于创面中心，与非洲刺鼠（Acomys）中观察到的现象不同。组织力学被认为参与组织形态发生。本文利用WIHN模型研究实验室小鼠与非洲刺鼠的力学与分子响应，发现这两个模型在时空形态发生场的形成上呈现相反趋势，并与创面硬度分布相关。转录组分析及K14-Cre-Twist1转基因小鼠显示，Twist1通路既介导表皮-真皮相互作用，又是周期性图案形成的感受因子，与发育中使用的通路不同。我们提出一个基于组织硬度的Turing模型，支持双尺度组织力学过程：(1) 在创面床内建立形态发生场（mm尺度）；(2) 形态发生场内表皮的对称性破缺并形成周期性排列的毛发基原（μm尺度）。由此，我们刻画了实验室小鼠与非洲刺鼠WIHN中构建Turing形态发生感受场的不同化学-力学事件，并揭示其进化-发育优势及对再生医学的前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 实验室小鼠与非洲刺鼠创伤诱导毛囊再生中，组织力学与分子信号如何建立形态发生场并决定毛囊基板的空间分布。
- 核心机制
- 创面硬度在5–15 kPa适宜范围内建立形态发生场，表皮Twist1作为化学-力学调控因子促进ECM重塑、表皮-真皮相互作用及毛囊基原形成，从而介导表皮对称性破缺。
- 主要证据
- AFM显示实验室小鼠创面中心较软；Blebbistatin软化创面增加毛囊数；非洲刺鼠创面由周边向中心形成毛囊基板；RNA-seq鉴定Twist1为上游调控因子；K14-Cre-Twist1、Harmine、GM6001及Twist1过表达实验支持Twist1与MMP调控作用。
- 研究意义
- 研究揭示实验室小鼠与非洲刺鼠WIHN中不同的化学-力学事件及进化-发育优势，为再生医学提供视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
测定创面组织硬度时空分布
比较创面中心与边缘硬度并关联毛囊形成区域。
使用AFM在PBS中以接触模式压痕测定创面不同区域的杨氏模量，并生成硬度热图。
软化创面验证硬度对毛囊新生的作用
检验降低创面硬度是否改变毛囊新生数量与形态发生场范围。
PWD10至PWD16每日局部施用Blebbistatin，PWD28计数新生毛囊并测定创面硬度。
分析胶原纤维组织与创面硬度关系
明确创面硬度的主要ECM构成及空间分布。
使用SHG成像观察PWD14与PWD21创面胶原纤维密度和厚度，并用IHC检测胶原I与III。
转录组分析鉴定Twist1上游调控因子
寻找创面中心与边缘差异表达基因及调控毛囊基板形成的上游因子。
取PWD14创面中心与边缘表皮进行RNA-seq，进行差异表达、通路富集及上游调控因子分析。
遗传与药理学扰动验证Twist1功能
验证表皮Twist1及其下游MMP对毛囊新生和创面硬度的作用。
使用K14-Cre-Twist1小鼠、Harmine、GM6001及Twist1过表达慢病毒处理创面，计数毛囊并测定硬度。
建立基于组织硬度的Turing模型
解释不同硬度空间分布下毛囊基板形成的差异模式。
构建包含激活子u、抑制子v和硬度E的Schnakenberg动力学Turing模型，模拟不同源强度下斑点形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AFM硬度测定 | NanoWizard 4a/CellHesion原子力显微镜 | JPK | -- |
| Arrow-TL1无针尖矩形悬臂 | NanoWorld | -- | |
| Gorilla Glue透明环氧胶 | Gorilla Glue Company | -- | |
| ALP染色 | BCIP/NBT显色底物 | Promega | -- |
| 抑制剂处理 | Blebbistatin | Cayman | -- |
| Harmine | Cayman | -- | |
| GM6001 | Cayman | -- | |
| 免疫组织化学 | Twist1抗体 | Abcam | ab50887 |
| 胶原I抗体 | Abcam | ab34710 | |
| 胶原III抗体 | Abcam | ab7778 | |
| MMP9抗体 | GeneTex | GTX100458 | |
| Snai1抗体 | Proteintech | 13099-1-AP | |
| P-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 13773-1-AP | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| Zeb2抗体 | Proteintech | 14026-1-AP | |
| RNA提取 | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNA-seq建库 | TruSeq RNA样本制备v2试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA-seq测序 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| 表皮-真皮分离 | 0.25%胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher | -- |
| RT-qPCR | Direct-zol RNA提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| Superscript III第一链合成试剂盒 | -- | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | -- | -- | |
| Agilent Mx3000P qPCR系统 | Agilent | -- | |
| 免疫组织化学 | AEC显色试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 创面模型建立 | 小鼠品系与周龄、创面尺寸与部位、非洲刺鼠周龄与创面尺寸 阅读提示：Methods中Animal model与Wound-induced hair neogenesis assay小节 |
| AFM硬度测定 | 最大压痕力5 nN、速率1 μm/s、测量温度32 °C、每区域至少5个压痕点、泊松比0.5 阅读提示：Methods中Atomic force microscopy小节 |
| 抑制剂处理 | Blebbistatin浓度100 μM、每日20 μl、PWD10至PWD16给药、溶剂DMSO 阅读提示：Methods中Inhibitor treatments小节 |
| RNA-seq取样与阈值 | PWD14创面、3 mm打孔分离中心与边缘、DEG阈值p或FDR<0.05 阅读提示：Methods中Harvesting wounds与RNA-seq and microarray analysis小节 |
| 转基因与慢病毒扰动 | K14-Cre-Twist1小鼠构建方式、Twist1过表达慢病毒PWD10施加、对照组设置 阅读提示：Methods中Animal model与Lentivirus production and transfection小节及Fig. 5图注 |