单细胞分化与信号异质性分析
解析黑色素瘤细胞系分化状态及MAPK信号的单细胞异质性
对16株BRAF突变黑色素瘤细胞系及原代黑色素细胞给予vemurafenib或联合trametinib，固定后多重免疫荧光检测Mitf、Ngfr、Axl、p-Erk、p-S6、Ki67，并进行t-SNE、Fano因子及细胞间距离分析
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
表观遗传调控揭示癌基因成瘾的分化状态特异性
Epigenetic modulation reveals differentiation state specificity of oncogene addiction.
实验完整度
高含16+株黑色素瘤细胞系体外筛选、单细胞成像、siRNA/CRISPR功能验证、PLSR/MLR建模及小鼠移植瘤体内验证
主要模型
BRAF突变黑色素瘤细胞系（16株及扩展至21株） 非转化人原代表皮黑色素细胞 A375与WM2664细胞系小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
表观遗传化合物筛选剂量0.2和1 μM，预处理24 h vemurafenib 100 nM单用或联合trametinib 10 nM SP2509 1 μM、JIB-04 200 nM、OTX015 200 nM、I-BET762 1 μM SP2577每日80 mg/kg腹腔注射，每组5只小鼠 单细胞免疫荧光检测Mitf、Ngfr、Axl、p-Erk、p-S6、Ki67
摘要
MAPK信号通路的过度激活促使临床将MAPK抑制剂用于BRAF突变黑色素瘤。然而，表观遗传可塑性导致的分化状态异质性使细胞间MAPK依赖状态存在差异，削弱了MAPK抑制剂的疗效。为鉴定这种变异的关键调控因子，我们在遗传背景多样及同基因的黑色素瘤细胞群体中，筛选了276种表观遗传修饰化合物（单独使用或与MAPK抑制剂联用）。通过单细胞分析和多变量建模，我们鉴定出三类表观遗传抑制剂，它们分别靶向与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶Kdm1a或Kdm4b之一、或BET溴结构域蛋白相关的不同表观遗传状态。黑色素细胞保持不敏感，而每种抑制剂的抗肿瘤疗效可根据黑色素瘤细胞的分化状态和MAPK活性进行预测。我们的系统药理学方法为鉴定可操作的（actionable）表观遗传因子提供了路径，这些因子可基于肿瘤细胞分化状态扩展BRAF癌基因成瘾范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黑色素瘤分化状态异质性是否由关键表观遗传变异介导，并决定细胞对MAPK依赖的状态及表观遗传抑制剂的疗效。
- 核心机制
- 三种表观遗传状态分别依赖Kdm1a（未分化细胞）、Kdm4b（神经嵴样细胞）和BET蛋白；其相对蛋白水平与分化标志Ngfr/Axl共同决定对SP2509、JIB-04及BET抑制剂的差异敏感性。
- 主要证据
- 在16株BRAF突变黑色素瘤细胞系中筛选276种表观遗传化合物，经单细胞免疫荧光、PLSR与MLR建模，并在siRNA敲低Kdm4b、CRISPR敲除KDM1A及小鼠移植瘤中得到验证。
- 研究意义
- 提出系统药理学路径，用于鉴定可操作的（actionable）表观遗传因子，基于肿瘤细胞分化状态扩展BRAF癌基因成瘾范式。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表观遗传化合物筛选
鉴定调控表型异质性的表观遗传因子
在COLO858与MMACSF细胞中筛选276种表观遗传修饰化合物，单独或与MAPK抑制剂联用，测定活细胞计数及p-Erk、p-Rb、Mitf
候选抑制剂跨细胞系验证
评估代表性表观遗传抑制剂的差异疗效及与MAPK抑制剂的联合作用
在8株及扩展至16株黑色素瘤细胞系和原代黑色素细胞中测试7种抑制剂，计算归一化生长率和Bliss偏差（DBI）
多变量建模预测疗效
建立分化状态与MAPK活性标志物对抑制剂疗效的预测模型
检测8种蛋白基线及处理诱导变化，用PLSR建模并留一法交叉验证，计算VIP评分
靶点功能验证
验证Kdm4b与Kdm1a对相应抑制剂敏感性的贡献
在WM115、WM902B、A2058中siRNA敲低KDM4A/B/5A/5B，或在A2058中CRISPR敲除KDM1A，检测细胞活力和标志物
蛋白标志物预测验证
验证Kdm4b、Znf217与Ngfr/Axl预测SP2509和JIB-04敏感性
在21株细胞系中免疫荧光定量四种蛋白，划分训练集14株与验证集7株，构建MLR模型
体内移植瘤验证
评估SP2577在体内对黑色素瘤生长的抑制作用
A375或WM2664细胞皮下接种裸鼠，成瘤后随机分组给予SP2577或溶剂，监测肿瘤体积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| EMEM培养基 | Corning | 10-009-CV | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 11330-032 | |
| RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| 真皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-200-030 | |
| 成人黑色素细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-200-042 | |
| MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| 药物处理 | 维莫非尼 | Selleck Chemicals | -- |
| 曲美替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 吉维诺司他 | Selleck Chemicals | -- | |
| CUDC-907 | Selleck Chemicals | -- | |
| JIB-04 | Selleck Chemicals | -- | |
| AZ6102 | Selleck Chemicals | -- | |
| I-BET-762 | Selleck Chemicals | -- | |
| OTX015 | Selleck Chemicals | -- | |
| SP2509 | Selleck Chemicals | -- | |
| SP2577 | MedChem Express | -- | |
| 免疫荧光染色 | Mitf抗体（克隆D5） | Abcam | ab3201 |
| p-ErkT202/Y204抗体（克隆D13.14.4E） | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Ki67抗体（克隆8D5） | Cell Signaling Technology | 9449 | |
| Axl抗体 | R&D Systems | AF154 | |
| p-RbS807/S811抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-16670 | |
| Ngfr抗体（克隆D4B3） | Cell Signaling Technology | 8238 | |
| p-S6S235/S236抗体（克隆D57.2.2E） | Cell Signaling Technology | 4851 | |
| Sox10抗体（克隆SOX10/991） | Abcam | ab212843 | |
| p-H2A.XS139抗体（克隆EP854(2)Y） | Abcam | ab195188 | |
| Kdm1a抗体（克隆C69G12） | Cell Signaling Technology | 2184 | |
| Kdm4a抗体（克隆C37E5） | Cell Signaling Technology | 5328 | |
| Kdm4b抗体（克隆D7E6） | Cell Signaling Technology | 8639 | |
| Kdm5a抗体（克隆EPR18651） | Abcam | ab194286 | |
| Kdm5a抗体（克隆EPR12704） | Abcam | ab181089 | |
| Znf217抗体 | Thermo Fisher Scientific | 720352 | |
| 抗兔Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A21206 | |
| 抗鼠Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A31571 | |
| 抗山羊Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher | A11057 | |
| 抗鼠Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher | A10037 | |
| 抗兔Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A31573 | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 1转染试剂 | GE Dharmacon | T-2001-01 |
| ON-TARGETplus人KDM4B SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-004290-00-0005 | |
| ON-TARGETplus人KDM4A SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-004292-00-0005 | |
| ON-TARGETplus人KDM5A SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-003297-02-0005 | |
| ON-TARGETplus人KDM5B SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-009899-00-0005 | |
| ON-TARGETplus非靶向对照siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | |
| CRISPR敲除 | Edit-R慢病毒Cas9核酸酶 | Dharmacon | VCAS10124 |
| KDM1A慢病毒sgRNA | Dharmacon | VSGH10142-246522030 | |
| KDM1A慢病毒sgRNA | Dharmacon | VSGH10142-246999191 | |
| KDM1A慢病毒sgRNA | Dharmacon | VSGH10142-246522028 | |
| 非靶向对照sgRNA | Dharmacon | VSGC10216 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Thermo Fisher | CB-40230C |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数仪 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 药物处理 | D300e数字分配器 | HP | -- |
| 成像 | ImageXpress Micro共聚焦高内涵成像系统 | Molecular Devices | -- |
| Operetta CLS高内涵成像系统 | Perkin Elmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 表观遗传化合物筛选 | 化合物剂量0.2和1 μM、预处理24 h、MAPK抑制剂处理72或120 h、每种条件2个生物学重复 阅读提示：Methods中Epigenetic compound screen小节及Fig. 2b图注 |
| 单细胞免疫荧光分析 | vemurafenib 100 nM、trametinib 10 nM、处理3–5天、t-SNE参数 阅读提示：Methods中Immunofluorescence staining与Single-cell analysis小节、Fig. 1图注 |
| 跨细胞系抑制剂验证 | 各抑制剂剂量（Givinostat 200 nM、CUDC-907 20 nM、JIB-04 200 nM、AZ6102 1 μM、I-BET762 1 μM、OTX015 0.2 μM、SP2509 1 μM）、预处理24 h 阅读提示：Fig. 3b和Fig. 5a图注、Methods中Epigenetic compound screen |
| siRNA与CRISPR功能验证 | siRNA 25 nM、转染后48 h加药、CRISPR MOI 0.3、检测96 h 阅读提示：Methods中Gene knockdown by siRNA与Gene knockout by CRISPR-Cas9小节 |
| 小鼠移植瘤实验 | 每只2.5×10^6细胞、肿瘤约170 mm3分组、每组5只、SP2577每日80 mg/kg腹腔注射、监测12天 阅读提示：Methods中In vivo xenograft assays小节 |
| 多变量建模 | 8株细胞系、8种蛋白标志物、三个时间点、两个生物学重复、留一法交叉验证 阅读提示：Methods中Partial least square regression小节、Fig. 5图注 |