胱氨酸饥饿蛋白质组学分析
鉴定胱氨酸饥饿相关的蛋白表达变化
UMRC6细胞在对照（200 μM）或低胱氨酸（1 μM）培养基中培养30 h，进行质谱分析，主成分分析和差异蛋白鉴定。
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mTORC1将胱氨酸/半胱氨酸可用性与GPX4蛋白合成及铁死亡调控相偶联
mTORC1 couples cyst(e)ine availability with GPX4 protein synthesis and ferroptosis regulation.
实验完整度
高包含细胞系、蛋白质组学、多种基因敲除/过表达、多聚核糖体分析及PDX体内验证，具功能与机制验证
主要模型
UMRC6肾癌细胞系 786-O肾癌细胞系 NCI-H1299肺癌细胞系 肺癌患者来源异种移植瘤（PDX）NSG小鼠模型
重点核对
胱氨酸饥饿处理：对照200 μM vs 低胱氨酸1 μM，处理24–30 h mTORC1抑制剂：Torin1 1 μM、AZD8055 1 μM、雷帕霉素（浓度文中未明确说明）处理24 h 铁死亡诱导：RSL3或ML162 1 μM，联合或不联合Ferrostatin-1 5 μM或DFO 100 μM，处理6–10 h PDX体内实验：AZD8055 10 mg/kg、IKE 30 mg/kg每日腹腔注射，每组n=5只小鼠 4EBP1 4A诱导表达：多西环素100 ng/ml处理30 h
摘要
谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）利用谷胱甘肽（GSH）解毒脂质过氧化，在抑制铁死亡中发挥重要作用。作为一种硒蛋白，GPX4的蛋白合成效率极低且能量消耗大。细胞如何将GPX4合成与营养可用性相协调仍不清楚。在本研究中，我们通过整合蛋白质组学和功能分析，揭示SLC7A11介导的胱氨酸摄取不仅促进GSH合成，还促进GPX4蛋白合成。机制上，我们发现胱氨酸/半胱氨酸激活雷帕霉素机制靶点复合物1（mTORC1），并至少部分通过Rag-mTORC1-4EBP信号轴促进GPX4蛋白合成。我们显示，药理学抑制mTORC1降低GPX4蛋白水平，使癌细胞对铁死亡敏感，并与铁死亡诱导剂协同抑制患者来源异种移植瘤在体内的生长。总之，我们的结果揭示了一种协调GPX4蛋白合成与胱氨酸/半胱氨酸可用性的调控机制，并建议在癌症治疗中联合使用mTORC1抑制剂和铁死亡诱导剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞如何将GPX4蛋白合成与胱氨酸/半胱氨酸可用性相协调，以及mTORC1是否参与铁死亡调控。
- 核心机制
- 胱氨酸/半胱氨酸通过Rag依赖、TSC非依赖的方式激活mTORC1，进而至少部分通过4EBP轴促进GPX4蛋白合成；该过程独立于GSH。
- 主要证据
- 蛋白质组学发现胱氨酸饥饿下调GPX4蛋白；多聚核糖体分析和荧光素酶报告基因显示胱氨酸促进GPX4翻译；RagA/B敲除、4EBP1 4A表达及4EBP1/2双敲除实验验证Rag-mTORC1-4EBP轴；PDX实验显示AZD8055与IKE联用协同抑制肿瘤生长并降低GPX4。
- 研究意义
- 揭示GPX4蛋白合成与胱氨酸可用性协调的调控机制，并提示mTORC1抑制剂与铁死亡诱导剂联合用于癌症治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SLC7A11/胱氨酸对GPX4蛋白水平的调控
确定胱氨酸摄取是否影响GPX4蛋白水平及mRNA水平
通过Western blot和RT-PCR检测不同浓度胱氨酸、erastin处理、SLC7A11敲除或过表达条件下GPX4蛋白和mRNA水平。
检测GPX4蛋白降解途径
排除GPX4蛋白水平下降由降解增加所致的可能性
使用蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂氯喹、LAMP2敲除及放线菌酮追踪实验检测GPX4蛋白稳定性。
多聚核糖体分析和翻译报告基因检测GPX4蛋白合成
验证胱氨酸是否调控GPX4mRNA的翻译效率
蔗糖梯度沉降分离多聚核糖体，RT-PCR检测GPX4转录本分布；荧光素酶报告基因融合GPX4 3′-UTR检测翻译活性。
验证SLC7A11通过GPX4调节铁死亡敏感性
确定SLC7A11对class 2 FINs诱导铁死亡敏感性的影响是否部分由GPX4水平介导
在SLC7A11敲除或过表达细胞中检测RSL3/ML162诱导的脂质过氧化和细胞活力；通过shRNA敲低或回补GPX4检测铁死亡敏感性变化。
验证GSH耗竭对GPX4及铁死亡敏感性的影响
检验胱氨酸调控GPX4是否依赖GSH合成
使用GCLC抑制剂BSO、GCLC敲低或GSH乙酯补充，检测GSH水平、GPX4蛋白水平及class 2 FINs诱导的铁死亡敏感性。
验证mTORC1在胱氨酸调控GPX4中的作用
确定mTORC1是否介导胱氨酸对GPX4蛋白合成的调控
检测胱氨酸饥饿和回补对mTORC1信号的影响；使用mTORC1抑制剂（雷帕霉素、Torin1、AZD8055）处理并检测GPX4蛋白水平及多聚核糖体分布；利用RagA/B双敲除、TSC1敲除、RICTOR敲除细胞验证通路。
验证4EBP轴在GPX4蛋白合成及铁死亡敏感性中的作用
确定mTORC1下游4EBP是否介导GPX4蛋白合成调控及铁死亡敏感性
使用多西环素诱导4EBP1 4A表达或4EBP1/2双敲除细胞，检测GPX4蛋白水平、多聚核糖体分布及RSL3/ML162诱导的铁死亡敏感性；组织芯片分析P-4EBP1与GPX4相关性。
PDX体内验证mTORC1抑制剂与铁死亡诱导剂联合效果
评估mTORC1抑制剂与铁死亡诱导剂联合在体内抑制肿瘤生长的效果
肺癌患者来源异种移植瘤NSG小鼠随机分组，每日腹腔注射AZD8055、IKE或联合，监测肿瘤体积和体重；终点进行H&E和免疫组化检测P-4EBP1、GPX4、4-HNE。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 透析胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 无丝氨酸培养基 | US biological | D9802-01 | |
| 无亮氨酸培养基 | ThermoFisher Scientific | 30030 | |
| 稳定细胞系构建 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003 |
| 质粒构建 | lentiCRISPR v2载体 | 文中未明确说明 | -- |
| pCW57.1-4EBP1 4A构建体 | Addgene | 38240 | |
| 药物处理 | Erastin | Sigma | E7781 |
| Ferrostatin-1 | Sigma | SML0583 | |
| 甲磺酸去铁胺 | Sigma | D9533 | |
| GSH乙酯 | Sigma | G1404 | |
| MG132 | Sigma | M7449 | |
| 二磷酸氯喹 | Sigma | C6628 | |
| 多西环素 | Sigma | D9891 | |
| Torin1 | ApexBio | A8312 | |
| AZD8055 | Selleckchem | S1555 | |
| Salubrinal | Selleckchem | S2923 | |
| 动物实验 | IKE | MedchemExpress | HY-114481 |
| 质谱分析 | Waters XBridge C18色谱柱 | Waters | -- |
| EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MaxQuant软件 | -- | -- | |
| Perseus | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | Cell Counting Kit-8试剂盒 | APExBIO | K1018 |
| FLUOstar Omega酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | Roche | -- |
| BD Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光显微镜 | EVOSfl显微镜 | Advanced Microscopy Group | -- |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| LAMP2抗体 | Abcam | 25631 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 实时PCR | TRIzol试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| SuperScript II逆转录酶 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal | ThermoFisher Scientific | 11762100 | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Biorad | 1620177 |
| HRP标记抗兔二抗 | Invitrogen | G-21040 | |
| HRP标记抗鼠二抗 | Invitrogen | G-21234 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32132 | |
| GPX4抗体 | R&D systems | MAB5457 | |
| 微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| 纽蛋白抗体 | Sigma | V4505 | |
| SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| p53抗体 | Santa Cruze | sc-126 | |
| LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 | |
| HIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 7096 | |
| TSC1抗体 | Cell Signaling Technology | 6935 | |
| 磷酸化S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9205 | |
| S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 磷酸化S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2215 | |
| S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 磷酸化4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| 4EBP2抗体 | Cell Signaling Technology | 2845 | |
| RagA抗体 | Cell Signaling Technology | 4357 | |
| RagB抗体 | Cell Signaling Technology | 8150 | |
| LAMP2抗体 | Cell Signaling Technology | 49067 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3398 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| 肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| Rictor抗体 | Cell Signaling Technology | 2140 | |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11染料 | Invitrogen | D3861 |
| 胱氨酸摄取实验 | 2-[1-14C]标记胱氨酸 | PekinElmer | -- |
| Tri-Carb液体闪烁分析仪 | PerKinElmer | Model 4810TR | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| pGL3荧光素酶报告载体 | 文中未明确说明 | -- | |
| Gen5酶标仪 | BIOTEK | -- | |
| 多聚核糖体分析 | Gradient Master梯度制备仪 | BioComp Instruments | -- |
| SW41超速离心管 | Backman | -- | |
| Trizol LS试剂 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白质合成检测 | 嘌呤霉素抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | PMY-2A4 |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| Immobilon-P膜 | 文中未明确说明 | -- | |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300-250 |
| ABC-HRP试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| 抗GPX4抗体 | Novus Biologicals | NBP2-54979 | |
| 磷酸化4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗4-HNE抗体 | Abcam | ab46545 | |
| 肾癌组织芯片 | US Biomax | BC07115a | |
| 显微镜 | Olympus | BX43 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 胱氨酸饥饿处理 | 对照培养基胱氨酸浓度200 μM，低胱氨酸培养基1 μM；处理时间24–30 h；使用透析胎牛血清 阅读提示：Methods 'Cell culture studies'及Fig. 1a图注 |
| mTORC1抑制剂处理 | Torin1 1 μM、AZD8055 1 μM处理24 h；雷帕霉素浓度文中未明确说明；需核对所用抑制剂对4EBP1磷酸化的抑制程度 阅读提示：Fig. 3b–d图注及Methods 'Constructs and reagents' |
| 铁死亡诱导及拯救实验 | RSL3或ML162浓度（如1 μM、300 nM、400 nM、500 nM、600 nM）及处理时间6–10 h；Ferrostatin-1 5 μM；DFO 100 μM 阅读提示：Fig. 2、Fig. 4图注 |
| 多聚核糖体分析 | 15–45%蔗糖密度梯度；离心36,000 × g 2 h 30 min；梯度组分中掺入荧光素酶RNA用于RT-qPCR归一化 阅读提示：Methods 'Polysome profiling analysis' |
| PDX体内联合治疗实验 | NSG小鼠每组n=5；AZD8055 10 mg/kg、IKE 30 mg/kg每日腹腔注射；溶剂10% DMSO/90%玉米油；肿瘤体积达200 mm³开始分组 阅读提示：Methods 'PDX experiments'及Fig. 4g图注 |
| 4EBP1 4A诱导表达实验 | 多西环素100 ng/ml处理30 h；需核对4EBP1 4A诱导表达水平 阅读提示：Fig. 3g, h图注 |