FET融合蛋白纯化与DNA结合验证
获得可用于体外实验的FET融合蛋白并确认其与靶DNA序列的特异性结合。
在大肠杆菌中表达并纯化EWS-FLI1、FUS-Gal4、FLI1DBD、Gal4DBD等蛋白，用EMSA检测蛋白与含结合位点DNA及对照序列的结合。
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FET融合癌蛋白的位点特异性相分离促进基因转录
Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.
实验完整度
高包含体外液滴、DNA幕帘单分子成像、荧光漂白恢复、体外转录、双荧光素酶报告及ChIP-seq/RNA-seq分析，多层级验证。
主要模型
293T细胞双荧光素酶报告体系 纯化FET融合蛋白体外液滴体系 DNA幕帘单分子DNA体系 Ewing肉瘤A673细胞ChIP-seq与RNA-seq数据
重点核对
EWS-FLI1和FUS-Gal4在靶位点形成凝聚体的蛋白浓度（如500 nM EWS-FLI1、150 nM FUS-Gal4） 体外转录使用25 mM KCl而非150 mM KCl，37 °C孵育20 min Gal4DBD结合位点阈值≥7×，GGAA重复阈值约3×（体外凝聚体）与约6×（荧光素酶） DNA幕帘工作缓冲液：40 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM DTT、0.2 mg/ml BSA、0.5 nM YOYO-1 双荧光素酶实验在转染后24 h检测，独立重复3次
摘要
异常形成的FUS/EWS/TAF15（FET）融合癌蛋白是多种人类癌症的关键致癌驱动因素。有趣的是，在分子水平上，它们还在特定基因座形成生物分子凝聚体。然而，这些凝聚体如何导致基因转录，以及DNA元件中编码的特征如何调控凝聚体形成，仍不清楚。本文中，我们开发了一种体外单分子实验来可视化DNA上的相分离。利用该技术，我们观察到FET融合蛋白在靶结合位点发生相分离，且相分离凝聚体招募RNA聚合酶II并增强基因转录。此外，我们确定了能够增强FET融合蛋白凝聚体形成的融合结合DNA元件阈值数量。这些发现提示，FET融合癌蛋白通过位点特异性相分离促进异常基因转录，这可能有助于其在相关癌症（如肉瘤和白血病）中的致癌转化能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FET融合癌蛋白形成的生物分子凝聚体如何导致基因转录，以及DNA结合元件的哪些特征调控凝聚体形成？
- 核心机制
- FET融合蛋白通过LCD-LCD及LCD-DBD等多价相互作用在靶DNA位点发生相分离，凝聚体招募未磷酸化Pol II CTD，进而激活靶位点附近的基因转录；DNA结合基序数量超过阈值可降低相分离临界浓度并促进凝聚体形成。
- 主要证据
- 体外液滴实验显示FET融合蛋白发生LLPS并被Pol II CTDN26招募；DNA幕帘单分子实验显示EWS-FLI1和FUS-Gal4在靶位点形成凝聚体并招募Pol II CTD；新开发的单分子凝聚体诱导转录实验显示FUS-Gal4和EWS-FLI1凝聚体显著提高转录效率；双荧光素酶实验和ChIP-seq/RNA-seq分析显示GGAA基序存在阈值效应。
- 研究意义
- 提供了凝聚体与基因转录激活之间因果关系的直接体外证据，有助于理解FET融合癌蛋白凝聚体如何导致转录活性，并为癌症治疗开发提供新工具和见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外液滴实验检测相分离
验证FET融合蛋白能否在体外发生液-液相分离并具有液态性质。
将不同浓度GFP或mCherry标记的融合蛋白与含或不含靶DNA的样品混合，显微成像观察液滴形成，并用FRAP检测荧光恢复。
DNA幕帘单分子成像观察靶位点凝聚体
在单分子水平可视化FET融合蛋白在特定DNA位点形成的凝聚体及其液态性质。
将含25× GGAA重复或7× Gal4DBD位点的Lambda DNA固定于脂质双层，注入mCherry或GFP标记蛋白，用TIRFM成像并分析 puncta 位置与强度。
检测凝聚体招募Pol II CTD
验证FET融合蛋白凝聚体能否在靶位点招募RNA聚合酶II的C端结构域。
在DNA幕帘上形成FUS-Gal4或EWS-FLI1凝聚体后注入Pol II CTDN26-mCherry，成像观察共定位；并用体外液滴实验检测招募。
建立单分子凝聚体诱导转录实验
直接验证凝聚体招募的RNA聚合酶能否激活靶位点附近的基因转录。
构建Pol II CTDN26-T7 RNAP融合蛋白，在DNA幕帘上形成FUS-Gal4或EWS-FLI1凝聚体后加入融合聚合酶和NTPs（含UTP-Fluor647），成像检测新生RNA。
双荧光素酶实验检测基序数量阈值
确定DNA结合基序数量对FET融合蛋白转录激活的阈值效应。
将不同数量结合基序克隆至最小启动子上游的火萤素酶载体，与FET融合蛋白共转染293T细胞，24 h后检测双荧光素酶活性并用Hill方程拟合。
ChIP-seq与RNA-seq生物信息学分析
在体内数据中验证GGAA微卫星数量与EWS-FLI1结合及基因表达的阈值关系。
重新分析已发表的Ewing肉瘤A673细胞ChIP-seq（GSE99959）和RNA-seq数据，按连续基序和总基序定义分析GGAA重复分布及EWS-FLI1富集。
DNA结合基序数量对体外凝聚体形成的调控
验证超过阈值的DNA结合基序数量驱动FET融合蛋白凝聚体形成。
将1×、5×、7×、11× Gal4DBD位点或3×、5×、7×、9×、13×、25× GGAA重复克隆入Lambda DNA，用DNA幕帘检测凝聚体形成并与基序分布分析比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
单分子成像与凝聚体定位
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | -- | -- |
| Superdex 200层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 分子克隆 | pRSF-Duet载体 | Novagen | -- |
| Addgene质粒26264、103831和35175 | Addgene | 26264, 103831, 35175 | |
| EMSA | Amersham Typhoon RGB成像仪 | -- | -- |
| 双荧光素酶实验 | pGL4.27火萤素酶载体 | Promega | E8451 |
| 海肾荧光素酶质粒 | Promega | E6921 | |
| 荧光素酶检测系统 | Promega | E1910 | |
| 体外液滴成像 | Nikon Ti-Eclipse倒置显微镜 | Nikon | -- |
| ORCA-Flash4.0 V3数字CMOS相机 | HAMAMATSU | C13440-20CU | |
| 共聚焦成像与FRAP | Nikon A1RMP共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- |
| DNA幕帘 | 链霉亲和素 | Invitrogen | A00045 |
| 二油酰磷脂酰胆碱 | -- | -- | |
| YOYO-1核酸染料 | -- | -- | |
| OBIS 488 nm和561 nm LS 100 mW激光器 | -- | -- | |
| 体外转录 | UTP-Fluor647 | GeneCopoia | C418B |
| T7 RNA聚合酶 | TAKARA | 6140 | |
| 无RNase DNase I | -- | -- | |
| Lambda DNA克隆 | MaxPlax Lambda包装提取物 | Lucigen | MP5105 |
| Lambda DNA制备 | Lambda DNA | NEB | N3011 |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| Lynx 4000离心机 | THERMO FISHER | -- | |
| 数据分析 | ImageJ图像分析软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外液滴实验 | 蛋白浓度（FUS-Gal4与EWS-FLI1均为2–30 μM）、DNA浓度（0.36 μM含11× Gal4DBD或1.5 μM含1×/25× GGAA）、缓冲液组成（150 mM KCl等）、FRAP重复数（n=6–12） 阅读提示：Fig. 1图注及Methods中In vitro droplet experiment and data analysis小节 |
| DNA幕帘单分子成像 | EWS-FLI1加载方式（500 nM经样品环加载后洗涤2 min再孵育10 min）、FUS-Gal4加载方式（150 nM灌注5 min后孵育10 min）、YOYO-1浓度0.5 nM、DNA基底类型与重复数（n=3） 阅读提示：Methods中DNA curtains与Injection of FET fusion proteins into the chamber小节及Fig. 2、Fig. 3图注 |
| 凝聚体招募Pol II CTD | Pol II CTDN26-mCherry浓度（1 μM，孵育10 min）、对照条件（无凝聚体时Pol II不结合DNA）、共定位判定标准 阅读提示：Fig. 3h及Supplementary Fig. 6图注与Results对应段落 |
| 体外单分子转录实验 | KCl浓度（25 mM vs 150 mM）、NTP浓度（5 μM ATP/CTP/GTP、2.5 μM UTP-Fluor647）、聚合酶用量约0.4单位、37 °C孵育20 min、各对照条件与重复数（n=3–4） 阅读提示：Fig. 4图注与Methods中In vitro single-molecule transcription assay小节 |
| 双荧光素酶实验 | 细胞系293T、转染后24 h检测、报告载体与内参载体、独立重复3次、Hill方程拟合及95%置信区间 阅读提示：Fig. 5图注与Methods中Luciferase assay小节 |
| ChIP-seq与RNA-seq分析 | 数据集编号（GSE99959、SRA059239）、连续基序与总基序定义（连接序列≤1 bp或≤20 bp）、峰鉴定FDR 1%、差异表达q<0.05 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation sequencing与GGAA microsatellites analysis小节及Supplementary Fig. 8 |