检测感染巨噬细胞的糖代谢变化
明确鼠伤寒沙门菌感染是否改变巨噬细胞糖酵解、氧化磷酸化及丝氨酸合成。
以鼠伤寒沙门菌感染小鼠腹腔巨噬细胞，用Seahorse细胞外通量分析仪检测ECAR和OCR，检测乳酸生成和葡萄糖摄取，并进行靶向定量代谢组学和转录组分析。
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鼠伤寒沙门菌通过III型分泌系统效应蛋白SopE2重编程巨噬细胞代谢以促进胞内复制和毒力
Salmonella Typhimurium reprograms macrophage metabolism via T3SS effector SopE2 to promote intracellular replication and virulence.
实验完整度
高含巨噬细胞体外模型、代谢组与转录组、细菌突变体、小鼠腹腔感染及生存分析，并完成SopE2-Cdc42、CRP-VrpA、CreBC-VrpB-SPI-2机制验证
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞（PMs） RAW264.7巨噬细胞系 HeLa细胞系 BALB/c小鼠腹腔感染模型
重点核对
感染模型的MOI：巨噬细胞为10，HeLa细胞为10；细菌培养至晚对数期或对数期 巨噬细胞感染后检测时间点：2、8、20 hpi；代谢组取样为8 hpi 小鼠腹腔注射约10^4 CFU，生存监测20天，第3天检测肝脾细菌负荷 PFK-15使用浓度6 μM于感染后1 h添加；NCT-503使用浓度5 μM 回补实验：3PG 1 mM；葡萄糖灌胃/腹腔注射20 mg每两天一次
摘要
鼠伤寒沙门菌通过在宿主巨噬细胞内复制建立全身性感染。本研究表明，感染鼠伤寒沙门菌的巨噬细胞表现出糖酵解上调、丝氨酸合成减少，导致糖酵解中间产物积累。对丝氨酸合成的影响由细菌蛋白SopE2介导，该蛋白是致病岛SPI-1编码的III型分泌系统（T3SS）效应蛋白。宿主代谢的改变通过两种机制促进鼠伤寒沙门菌的胞内复制：葡萄糖水平降低导致细菌对2-和3-磷酸甘油酸及磷酸烯醇式丙酮酸（碳源）的摄取上调，而丙酮酸和乳酸水平升高诱导另一个已知编码毒力因子的致病岛SPI-2上调。药理学或遗传学抑制宿主糖酵解、激活宿主丝氨酸合成，或缺失针对这些宿主糖酵解中间产物的细菌转运系统或信号感应系统，均会削弱鼠伤寒沙门菌的复制或毒力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鼠伤寒沙门菌感染如何改变巨噬细胞葡萄糖代谢，以及这些代谢改变如何促进细菌胞内复制和全身性毒力。
- 核心机制
- 细菌通过SPI-1 T3SS效应蛋白SopE2经Cdc42抑制巨噬细胞丝氨酸合成关键酶Phgdh，导致糖酵解中间产物3PG、丙酮酸和乳酸积累；细菌在低葡萄糖下经cAMP-CRP-VrpA上调PgtP摄取3PG作为碳源，并感受丙酮酸和乳酸经CreBC-VrpB激活SPI-2基因表达。
- 主要证据
- 巨噬细胞代谢组和转录组显示糖酵解上调、丝氨酸合成下降；Pfkfb3或Phgdh敲低/过表达及NCT-503处理改变细菌复制；pgtP、sopE2、vrpA、crp、creB、vrpB突变体在巨噬细胞和小鼠感染中复制及毒力下降，EMSA和ChIP-qPCR验证调控结合。
- 研究意义
- 揭示沙门菌通过T3SS效应蛋白重编程宿主巨噬细胞葡萄糖代谢，并利用积累的糖酵解中间产物作为碳源和信号促进胞内复制与系统性感染；Phgdh可能成为控制鼠伤寒沙门菌系统性感染的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证糖酵解和丝氨酸合成对细菌胞内复制的影响
检验巨噬细胞糖酵解增强及丝氨酸合成抑制是否促进鼠伤寒沙门菌胞内复制。
在RAW264.7细胞中siRNA敲低Pfkfb3或用PFK-15处理PMs抑制糖酵解；在RAW264.7细胞中过表达或siRNA敲低Phgdh，或用NCT-503处理PMs，检测细菌胞内复制。
鉴定细菌抑制丝氨酸合成的效应蛋白
确定鼠伤寒沙门菌中负责抑制巨噬细胞丝氨酸合成的因子及其宿主靶点。
比较SPI-1突变体、SPI-2突变体及SPI-1各效应蛋白基因突变体感染后巨噬细胞phgdh转录和Phgdh蛋白水平；用sopE2过表达、回补及Cdc42 siRNA敲低验证SopE2-Cdc42通路。
验证3PG转运对细菌胞内复制和毒力的作用
检验鼠伤寒沙门菌是否利用宿主积累的3PG作为碳源促进胞内复制和系统性感染。
构建pgtP、uhpt、cstA-ybdD、lldP等转运系统突变体，检测体外唯一碳源生长、巨噬细胞胞内复制（庆大霉素保护实验和免疫荧光）及小鼠腹腔感染后的生存率和肝脾细菌负荷；用葡萄糖或3PG回补验证碳源作用。
解析细菌感应低葡萄糖并上调3PG摄取的调控通路
阐明胞内鼠伤寒沙门菌如何感应宿主葡萄糖降低并上调pgtP表达。
通过转录组筛选鉴定VrpA，用RT-qPCR、EMSA和ChIP-qPCR验证VrpA直接结合pgtP启动子；验证CRP结合vrpA启动子及cAMP依赖性，检测胞内细菌cAMP水平和crp、vrpA、pgtP转录。
解析细菌感应丙酮酸和乳酸激活SPI-2的调控通路
确定宿主积累的丙酮酸和乳酸是否作为信号经CreBC-VrpB激活SPI-2基因表达。
构建creBC-lux报告融合检测胞内表达；构建creB、vrpB突变体及回补菌株，检测巨噬细胞复制和小鼠毒力；用RNA-seq、EMSA和ChIP-qPCR验证CreB直接调控vrpB、VrpB结合ssrA和ssrB启动子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | 11879020 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147 | |
| 抑制巨噬细胞糖酵解 | PFK-15 | Sigma | SML1009 |
| 小鼠腹腔注射回补葡萄糖 | D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7021 |
| 检测巨噬细胞葡萄糖摄取 | 2-NBDG | ENZO | PEP-23002 |
| 检测丝氨酸浓度 | 小鼠丝氨酸ELISA试剂盒 | Jianglai Bio | -- |
| siRNA转染 | INTERFERin转染试剂 | Polyplus Transfection | PT-409-10 |
| 质粒转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus Transfection | PT-114-07 |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | RR047A |
| Phgdh过表达载体构建 | pcDNA3.1 (+)载体 | Invitrogen | V87020 |
| 检测乳酸浓度 | 乳酸检测试剂盒 | Abcam | ab65330 |
| Western blot细胞裂解 | 放射免疫沉淀分析缓冲液 | Solarbio | R0010 |
| Western blot凝胶电泳 | SurePAGETM凝胶 | GenScript | M00653 |
| Western blot二抗 | 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗 | Sparkjade | EF0002 |
| Western blot一抗 | 抗PHGDH抗体 | Cell Signaling Technology | 13428 |
| 抗PFKFB3抗体 | Abcam | ab181861 | |
| 抗CDC42抗体 | Abcam | ab187643 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Abcam | ab179467 | |
| Western blot化学发光检测 | SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Genestar | E170-01 |
| 免疫荧光染色 | 山羊抗小鼠IgG（FITC） | Abcam | ab6785 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNA纯化 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 柱上DNase I | Qiagen | 79254 | |
| RT-qPCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4367659 |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | RR036A |
| 检测细菌cAMP浓度 | 直接cAMP ELISA试剂盒 | Abcam | ab133051 |
| ChIP | 抗FLAG小鼠单克隆抗体 | Sigma | F1804 |
| Protein A磁珠 | Invitrogen | 88846 | |
| ChIP-seq文库构建 | NEXTflex™ Rapid DNA-Seq试剂盒 | Bioo Scientific | -- |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext® Ultra™定向RNA文库构建试剂盒（Illumina®） | New England Biolabs | -- |
| EMSA | 环磷酸腺苷 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞感染与胞内复制检测 | MOI=10、细菌晚对数期、离心同步感染1000×g 5 min、感染30 min、庆大霉素100 μg/mL处理2 h后改为10 μg/mL、检测时间点2和20 hpi 阅读提示：Methods中“STM infection of macrophages”小节；Fig. 2、Fig. 3图注 |
| 巨噬细胞糖代谢与丝氨酸/3PG检测 | Seahorse检测时间点2、8、20 hpi；代谢组8 hpi；丝氨酸/3PG检测在无丝氨酸RPMI中感染8 h；样本量n=3次独立实验 阅读提示：Methods中“Seahorse analysis”“Metabolomics analysis”“Serine and 3PG concentration measurements”小节；Fig. 1、Fig. 2图注 |
| 糖酵解和丝氨酸合成干预实验 | PFK-15为6 μM于感染后1 h加入；NCT-503为5 μM；Pfkfb3 siRNA敲低48%；Phgdh过表达约2.0–2.7倍；Phgdh siRNA敲低39%或44% 阅读提示：Methods中“SiRNA and overexpression plasmid transduction”及“STM infection of macrophages”小节；Fig. 2图注 |
| 小鼠系统性感染与竞争实验 | BALB/c雄性6–8周龄；腹腔注射约10^4 CFU；生存监测20天；第3天取肝脾计CFU；竞争感染按1:1混合；葡萄糖每两天腹腔注射20 mg 阅读提示：Methods中“Mice”“In vivo mouse infection models”小节；Fig. 3、Fig. 5、Fig. 6图注 |
| 细菌调控机制验证（EMSA/ChIP-qPCR） | 细菌在N-minimal medium培养6 h；EMSA使用40 ng启动子DNA，CRP反应含0.1 mM cAMP；ChIP使用FLAG标签菌株和抗FLAG抗体；ChIP-qPCR用2−ΔΔCt计算富集 阅读提示：Methods中“Electrophoretic mobility shift assay”“Chromatin immunoprecipitation”“ChIP-qPCR”小节；Fig. 5、Fig. 6图注 |