单细胞RNA测序解析心肌梗死后内皮细胞动力学
探究心肌梗死后不同时间点内皮细胞的基因表达变化和细胞状态
对小鼠心脏非心肌细胞组分在心肌梗死后第0、1、3、5、7、14、28天进行单细胞RNA测序，鉴定内皮细胞亚群并进行GO富集和细胞周期分析
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单细胞测序揭示心肌梗死后内皮细胞可塑性伴短暂间充质活化
Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.
实验完整度
高包含scRNA-seq、谱系追踪小鼠、免疫染色、FACS、体外功能及代谢和DNA甲基化验证
主要模型
C57BL/6J小鼠心肌梗死模型 Cdh5-CreERT2;mT/mG谱系追踪小鼠 Col1a2-CreERT2;mT/mG谱系追踪小鼠 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)
重点核对
小鼠每个时间点n=1，单细胞RNA测序分析 Cdh5-CreERT2;mT/mG小鼠他莫昔芬诱导剂量2 mg/只/天，连续1周 Galunisertib (LY2157299) 75 mg/kg灌胃，心肌梗死前2小时、梗死后24小时及之后每天两次 TGF-β2处理HUVEC浓度10 ng/mL，处理3天后撤除 Confetti小鼠克隆扩增分析，每个边界区图像分6个相同大小区域计数
摘要
内皮细胞在组织适应损伤中起关键作用。梗死诱导的组织缺血导致内皮细胞功能深刻改变，并可诱导向间充质状态转变。本研究利用单细胞RNA测序探索心肌梗死后内皮细胞的动力学和个体细胞反应。本研究表明内皮细胞增殖和炎症的时间依赖性转换，伴随代谢基因特征的短暂变化。轨迹分析显示，心肌梗死后3至7天的大多数内皮细胞获得一种短暂状态，其特征在于间充质基因表达，并在损伤后14天恢复到基线。使用Cdh5-CreERT2;mT/mG小鼠进行谱系追踪，随后进行单细胞RNA测序，证实了短暂的间充质转变，并揭示了损伤后早期和晚期状态内皮细胞的额外缺氧和炎症特征。这些数据表明，内皮细胞在心肌梗死后最初几天经历短暂的间充质活化，伴随代谢适应，但并未获得长期间充质命运。这种间充质活化可能促进内皮细胞迁移和克隆扩增，以再生血管网络。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 心肌梗死后内皮细胞是否及如何发生间充质转变，其动力学和可逆性如何？
- 核心机制
- 心肌梗死诱导内皮细胞短暂间充质活化(EndMA)，伴随从脂肪酸氧化向糖酵解的代谢转换，该过程依赖于TGF-β信号且可逆，不获得长期间充质命运。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序轨迹分析显示梗死后3-7天多数内皮细胞获得间充质基因表达状态，14天恢复基线；Cdh5谱系追踪证实短暂间充质标记表达；体外TGF-β2刺激和撤除实验证实可逆性；TGF-β抑制剂减少内皮克隆扩增。
- 研究意义
- EndMA可能促进内皮细胞迁移和克隆扩增以再生血管网络，并可能解释文献中EndMT长期命运研究的争议。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
轨迹分析鉴定内皮细胞间充质活化状态
无偏识别心肌梗死后内皮细胞获得的不同状态及其转变轨迹
使用Monocle进行伪时间轨迹分析，鉴定内皮细胞状态，分析状态4的基因表达特征，并通过bulk RNA测序验证间充质标记诱导
谱系追踪验证间充质活化的短暂性
确定内皮细胞是否获得长期间充质命运或发生可逆转变
使用Cdh5-CreERT2;mT/mG小鼠进行内皮谱系追踪，心肌梗死后不同时间点进行单细胞RNA测序和免疫染色；使用Col1a2-CreERT2;mT/mG小鼠追踪间充质细胞向内皮表型逆转
TGF-β抑制剂干预内皮克隆扩增
验证间充质活化是否贡献于内皮细胞增殖和扩增
使用TGF-β抑制剂Galunisertib处理Confetti小鼠，心肌梗死后7天评估边界区内皮克隆扩增
体外验证EndMT可逆性及代谢适应
探究TGF-β2诱导的内皮间充质转变是否可逆及代谢变化
HUVEC用TGF-β2处理3天后撤除，检测间充质标记基因表达；使用Seahorse和13C葡萄糖代谢流分析糖酵解；DNA甲基化分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | T5648 |
| Galunisertib | AdooQ | A11017 | |
| 单细胞RNA测序 | 多组织解离试剂盒2 | Miltenyi | 130-110-203 |
| 死细胞去除磁珠 | Miltenyi | 130-090-101 | |
| Chromium单细胞3′ v3试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| DynaBeads MyOne硅珠 | Thermo Fisher Scientific | 37002D | |
| SPRIselect试剂盒 | Beckman Coulter | B23318 | |
| 高灵敏度DNA芯片 | Agilent Genomics | 5067-4627 | |
| 免疫组织化学 | HBSS缓冲液 | Gibco | 14025-050 |
| DPBS缓冲液 | Gibco | 14190-094 | |
| 蔗糖 | Sigma | S0389-1kg | |
| 明胶 | Sigma | G1890-100G | |
| 牛血清白蛋白 | Roth | 0163.2 | |
| 驴血清 | abcam | 7475 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| 细胞培养 | 人纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F0895 |
| μ-slide八孔腔室载玻片 | Ibidi | 80826 | |
| 内皮基础培养基 | Lonza | CC3121 | |
| 氢化可的松 | Lonza | CC-4035C | |
| 抗坏血酸 | Lonza | CC-4116C | |
| 牛脑提取物 | Lonza | CC-4092C | |
| 表皮生长因子 | Lonza | CC-4017 | |
| 胎牛血清 | Lonza | CC-4101 | |
| 庆大霉素+两性霉素B-1000 | Lonza | CC-4081C | |
| EndMT诱导 | 转化生长因子β2 | R&D System | 302-B2 |
| 转化生长因子β1 | R&D System | 240-B | |
| 白细胞介素1β | Peprotech | 200-01B | |
| N-硝基精氨酸甲酯 | -- | -- | |
| 细胞周期抑制 | Vitexicarpin | Chem Faces | CFN98172 |
| RNA分析 | miRNeasy试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| DNase I | Qiagen | 79254 | |
| MMLV逆转录酶 | Life technologies | N8080018 | |
| Fast SYBR Green预混液 | Life Technologies | 4385612 | |
| FACS分析 | BrdU试剂盒 | BD Pharmingen | 559619 |
| 糖酵解通量分析 | Seahorse XF96培养板 | Agilent Technologies | -- |
| DNA甲基化分析 | QIAamp DNA微量试剂盒 | Qiagen | 56304 |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q32851 | |
| Infinium Human-Methylation EPIC BeadChip (850k) | Illumina | WG-317 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠心肌梗死模型 | 小鼠品系、年龄、性别、LAD结扎手术细节、心肌梗死确认方法 阅读提示：Methods-Animals小节 |
| 谱系追踪 | 他莫昔芬剂量(2 mg/只/天，连续1周)、注射途径(腹腔)、诱导时间窗口 阅读提示：Methods-Animals小节 |
| 单细胞RNA测序 | 组织解离方法、细胞分选策略、测序平台(10X Chromium)、数据分析流程(Seurat版本、聚类参数) 阅读提示：Methods-Single-cell RNA sequencing小节和Figure legends |
| TGF-β抑制剂体内处理 | Galunisertib剂量(75 mg/kg)、给药途径(口服灌胃)、给药时间点(梗死前2小时、梗死后24小时及之后每天两次)、溶剂配方(0.5%羧甲基纤维素) 阅读提示：Methods-Animals小节 |
| 体外EndMT诱导和逆转 | TGF-β2浓度(10 ng/mL)、处理时间(3、7或10天)、撤除后培养时间(4天)、培养基补充物(去除EGF和牛脑提取物) 阅读提示：Methods-Endothelial-to-mesenchymal transition assay小节 |
| 克隆扩增分析 | Confetti小鼠品系、边界区图像分析策略(每动物n=5图像，每图像分6区域)、克隆扩增定义(超过动物均值2倍标准差) 阅读提示：Methods-Statistics and reproducibility小节 |