T7噬菌体展示筛选RAGE胞质尾结合蛋白
鉴定与RAGE胞质尾相互作用的候选蛋白。
以GST-RAGE(CT)为诱饵，对T7噬菌体人肺cDNA文库进行三轮生物淘选，回收噬菌体并测序鉴定候选结合蛋白。
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靶向RAGE的接头蛋白SLP76作为致死性脓毒症的治疗策略
Targeting adaptor protein SLP76 of RAGE as a therapeutic approach for lethal sepsis.
实验完整度
高包含体外结合、细胞信号、基因敲除小鼠、CLP模型及患者血清样本等多层级证据，并有功能与机制验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞系 HEK293细胞系 C57BL/6小鼠CLP脓毒症模型 SLP76−/−和AGER−/−小鼠骨髓来源巨噬细胞
重点核对
AGEs-BSA处理剂量100 μg/ml及处理时间15 min（信号检测）或12 h（细胞因子检测） SLP76−/−和AGER−/−小鼠的基因型鉴定及BMDMs分离 CLP术后1 h尾静脉注射TAT-SAM 10 μM，观察7天生存率 Co-IP中anti-HA或anti-Flag beads的使用及500 μg输入蛋白量 患者脓毒症诊断依据Sepsis-3标准，血清AGEs用ELISA检测
摘要
越来越多的证据表明RAGE在脓毒症发病机制中具有重要功能。然而，RAGE在脓毒性休克过程中向下游激酶级联传递信号的机制尚不清楚。在此，我们鉴定出SLP76是RAGE胞质尾在体外和体内的结合伙伴，并证明SLP76通过其无菌α基序（SAM）与RAGE结合以介导下游信号传导。RAGE或SLP76的基因缺陷可减少AGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β磷酸化以及细胞因子释放。通过TAT细胞穿透肽将SAM结构域递送至巨噬细胞可阻断促炎细胞因子的产生。此外，给予TAT-SAM可减轻盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠的炎性细胞因子释放和组织损伤，并保护这些小鼠免受脓毒症的致死性。这些发现揭示了SLP76在RAGE介导的促炎信号传导中的重要作用，并为开发靶向SLP76的脓毒症治疗药物提供了线索。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAGE在脓毒症中如何将信号传递至下游激酶级联，以及能否靶向该信号通路治疗脓毒症。
- 核心机制
- SLP76通过其SAM结构域与RAGE胞质尾的DCT区域结合，介导AGE/RAGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β磷酸化及促炎因子释放；阻断该结合可抑制信号传导。
- 主要证据
- T7噬菌体展示筛选出SLP76；Co-IP、FRET和SPRi证实SAM-DCT结合；SLP76或AGER基因缺陷及siRNA降低AGE诱导的激酶磷酸化和细胞因子释放；TAT-SAM肽抑制信号并改善CLP小鼠生存率、减少组织损伤。
- 研究意义
- 揭示SLP76在RAGE介导促炎信号中的重要作用，为开发靶向SLP76的脓毒症治疗策略提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SLP76与RAGE胞质尾的相互作用
确认SLP76与RAGE胞质尾在体外和细胞内的结合。
纯化GST-RAGE(CT)和His-SLP76进行体外pull-down；在HEK293细胞中共转染HA-RAGE和Flag-SLP76，用AGEs处理后进行Co-IP；在RAW264.7细胞中检测内源性结合。
鉴定RAGE与SLP76的结合结构域
确定介导RAGE-SLP76相互作用的关键结构域。
构建RAGE胞质尾缺失、D-domain缺失和DCT缺失突变体以及SLP76磷酸化位点突变体和SAM缺失突变体，通过Co-IP和FRET检测结合；用合成肽进行SPRi检测亲和力。
检测AGE/RAGE对巨噬细胞信号通路的激活
明确AGEs激活的下游激酶及其剂量和时间依赖性。
用AGEs处理RAW264.7细胞，western blot检测p38 MAPK、ERK1/2、JNK和IKKα/β的磷酸化。
验证SLP76在RAGE介导信号中的必要性
确定SLP76及其SAM结构域对RAGE下游信号传导的必要性。
在HEK293细胞中共过表达RAGE和SLP76或其突变体，用AGEs刺激后检测激酶磷酸化；用siRNA敲低RAW264.7细胞中AGER或SLP76；分离SLP76−/−和AGER−/−小鼠BMDMs进行验证。
评估SLP76在AGE诱导的细胞因子和趋化因子释放中的作用
确定SLP76对RAGE介导的促炎介质产生的影响。
用siRNA敲低RAGE或SLP76，或用SLP76−/−和AGER−/−小鼠BMDMs，经AGEs刺激后，用ELISA或LiquiChip检测细胞因子和趋化因子。
测试TAT-SAM肽对RAGE-SLP76相互作用的阻断效果
验证靶向SAM结构域能否抑制RAGE介导的促炎信号。
用TAT-SAM或对照TAT预处理RAW264.7细胞，再用AGEs刺激，检测激酶磷酸化和细胞因子释放。
评估TAT-SAM对CLP脓毒症小鼠的治疗效果
在体内验证靶向SLP76-SAM对脓毒症的保护作用。
CLP术后1 h尾静脉注射TAT-SAM或对照，观察7天生存率，检测血清细胞因子及肺、肝组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选与鉴定结合蛋白
验证信号通路激活
验证细胞因子和趋化因子释放
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞刺激 | AGEs-BSA | Biovision | 2221-10 |
| 重组小鼠HMGB1 | Abcam | ab181949 | |
| Western blot | 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 |
| 抗磷酸化ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗磷酸化SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 抗p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 抗磷酸化p38 MAPK (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 抗磷酸化IKKα/β (Ser176/180)抗体 | Cell Signaling Technology | 2679 | |
| 抗SLP76抗体 | Cell Signaling Technology | 4958 | |
| 抗HA标签 (C29F4)抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗RAGE (N-16)多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8230 | |
| 抗IKKα/β (H-470)多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7607 | |
| Co-IP | 抗Flag标签单克隆抗体 | Sigma | F3165 |
| ANTI-FLAG® M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 | |
| EZviewTM Red抗HA亲和凝胶 | Sigma | E6779 | |
| siRNA转染 | SLP76 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-36502 |
| RAGE siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-36375 | |
| 对照siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-142627 | |
| Co-IP | Protein G磁珠 | Roche | 11719416001 |
| 质粒制备 | 质粒Plus Midi试剂盒 | Qiagen | 12945 |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Miltenyi Biotec | 130-094-129 |
| ELISA | AGEs ELISA试剂盒 | MyBioSource | MBS267540 |
| TNF ELISA试剂盒 | R&D Systems | MTA00B | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M6000B | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR036A |
| Western blot | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | GE10600002 | |
| 增强化学发光 | Thermo Fisher Scientific | 32109 | |
| DNA转染 | GeneJammer转染试剂 | Agilent | 204130 |
| siRNA转染 | HiPerFect转染试剂 | Qiagen | 301705 |
| 蛋白定量 | BCA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| T7噬菌体展示 | T7Select®人肺cDNA文库 | Novagen | 70646-3 |
| 多肽合成 | TAT肽 | Bootech BioScience & Technology | -- |
| TAT-SAM肽 | Bootech BioScience & Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | AGEs处理浓度100 μg/ml，处理时间15 min（信号检测）或12 h（细胞因子检测） 阅读提示：Methods中Reagents and antibodies及Figure legends 1–5 |
| 基因敲除小鼠与BMDMs | SLP76−/−和AGER−/−小鼠来源、遗传背景及BMDMs分化条件（M-CSF 20 ng/ml，7天） 阅读提示：Methods中Mice and cell lines和Isolation of BMDMs |
| CLP模型与TAT-SAM给药 | CLP手术细节（18-gauge针穿刺两次）、TAT-SAM剂量10 μM、术后1 h尾静脉注射、生存观察7天 阅读提示：Methods中Animal model of CLP和Survival study，Figure 6d |
| Co-IP与FRET | 转染质粒量、Co-IP输入蛋白500 μg、FRET n=5及校正方法 阅读提示：Methods中Co-IP和FRET measurement |
| 患者样本 | 脓毒症诊断标准Sepsis-3，患者n=9，健康对照n=3 阅读提示：Methods中Human blood samples，Figure 6a |