JMJD3在重编程中的双向效应验证
确定JMJD3过表达对重编程效率的影响是否受成纤维细胞衰老状态和Vc影响
在P2和P4代OG2 MEFs中转导OSKM并过表达JMJD3，加或不加Vc，计数AP+和GFP+集落；并在TTF和pre-iPSC中验证
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JMJD3与KLF4协同促进多能性重编程
JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency.
实验完整度
高含MEF、TTF、NPC、pre-iPSC、EpiSC等多模型，RNA-seq、ChIP-seq、3C、MS及功能回补验证
主要模型
OG2 MEFs（P2和P4代） OG2 TTFs（P1和P3代） pre-iPSCs OG2 EpiSCs及Rex1GFPd2-EpiLCs
重点核对
MEF代次（P2与P4）及Vc（50 μg/ml）处理对JMJD3效应方向的影响 JMJD3催化突变体（T1385A/H1388A）与野生型JMJD3在重编程中的对比 Jmjd3敲低/敲除及shRNA抗性突变体的回补验证 KLF4高水平与低水平条件下JMJD3与KLF4的协同作用 Nipbl敲低对JMJD3增强重编程及EpiSC-to-naïve转化的阻断
摘要
Yamanaka因子（OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC）与转录/表观遗传辅调节因子在体细胞重编程中的相互作用尚不完全清楚。在此，我们证明组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）去甲基化酶JMJD3在小鼠重编程中发挥相互矛盾的作用。一方面，JMJD3以不依赖重编程因子的方式诱导促衰老因子Ink4a并降解多能性调节因子PHF20。另一方面，JMJD3被KLF4特异性招募，以降低上皮基因和多能性基因增强子和启动子处的H3K27me3。JMJD3还通过黏连蛋白装载因子NIPBL促进增强子-启动子成环并最终促进转录延伸。这种力量竞争可通过使用早期传代成纤维细胞或用维生素C增强JMJD3的催化活性而向提高重编程效率的方向转变。因此，我们的工作确立了JMJD3的多方面作用，将其定位为KLF4的关键伙伴以及协助染色质相互作用和激活基因转录的支架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 组蛋白去甲基化酶JMJD3在体细胞重编程中究竟发挥何种作用，其与Yamanaka因子特别是KLF4如何协同调控重编程？
- 核心机制
- KLF4招募JMJD3至上皮和多能性基因的增强子与启动子，降低H3K27me3并促进H3K27ac转换、增强子-启动子成环和转录延伸；同时JMJD3以不依赖重编程因子的方式诱导Ink4a并降解PHF20，两种相反作用的平衡决定重编程结局。
- 主要证据
- 在P2和P4代MEF、TTF、pre-iPSC、EpiSC及EpiLC等多模型中，通过JMJD3过表达、敲低、敲除和催化突变体结合RNA-seq、ChIP-seq、3C-PCR、免疫共沉淀和质谱，证明JMJD3的效应依赖其催化活性并与KLF4协同；Nipbl敲低阻断JMJD3的增强作用。
- 研究意义
- 建立了JMJD3和KLF4在多种细胞命运转变中的新图景，对理解这两个因子在正常生理和疾病中的复杂作用具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
JMJD3催化活性依赖性的验证
检验JMJD3增强重编程是否依赖其H3K27me3去甲基化酶活性
构建JMJD3催化失活突变体（T1385A/H1388A），在P2 MEFs中过表达并检测H3K27me3水平和GFP+集落数；同时用shRNA敲低Jmjd3并用抗shRNA突变体回补
JMJD3调控的基因表达网络分析
鉴定JMJD3在重编程早期和晚期调控的基因类别
在重编程第5天和第10天进行RNA-seq，比较JMJD3过表达和敲低后的差异表达基因，并与MEFs和PSCs表达谱比较分组
H3K27me3去甲基化与基因激活的时序关系
确定JMJD3介导的H3K27me3去除是否先于靶基因激活
在WT和Jmjd3 KO P2 MEFs重编程第5天和第10天进行H3K27me3 ChIP-seq（含Drosophila spike-in），并与RNA-seq数据关联分析
KLF4与JMJD3的协同作用验证
检验JMJD3是否通过KLF4招募至靶位点并协同激活上皮和多能性基因
在OSM+高水平或低水平KLF4条件下过表达JMJD3，检测GFP+集落、H3K27me3 ChIP-qPCR和上皮/多能性基因表达；并进行JMJD3与OSKM的免疫共沉淀
全基因组KLF4和JMJD3结合及染色质互作分析
在全基因组水平解析KLF4和JMJD3的共结合模式及其对染色质结构的影响
在OSKM重编程第5天进行KLF4和JMJD3 ChIP-seq，比较结合峰重叠和基序富集；进行H3K27ac ChIP-seq和3C-PCR检测增强子-启动子成环
JMJD3互作蛋白及转录延伸调控验证
鉴定JMJD3的互作蛋白并验证其在增强子-启动子成环和转录延伸中的作用
对FLAG-JMJD3进行免疫共沉淀-质谱分析，验证与NIPBL、黏连蛋白、中介体、p300、CDK9和BRD4的相互作用；用Nipbl敲低测试对JMJD3增强重编程的影响；ChIP-qPCR检测Pol II
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | NTC | -- | |
| GlutaMax添加剂 | Invitrogen | -- | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| PD0325901 | -- | -- | |
| 激活素A | R&D | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | -- | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 重编程 | 维生素C | Sigma | A4034 |
| 细胞培养 | 骨形态发生蛋白4 | -- | -- |
| EpiSC-to-naïve转化 | ROCK抑制剂Y-27632 | Selleck | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | -- | |
| RNA提取 | RNAzol RT RNA提取试剂 | MRC | -- |
| RT-qPCR | SYBR green染料 | Takara | -- |
| 免疫荧光 | 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗H3K27me3抗体 | Millipore | 07-449 | |
| 抗NANOG抗体 | BETHYL | A300-397A | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Amersham ECL化学发光试剂 | GE Healthcare | -- | |
| FUSION SOLO 4M成像仪 | Vilber Lourmat | -- | |
| 免疫共沉淀 | NE-PER核质分离提取试剂 | Thermo Scientific | 78833 |
| 抗FLAG M2磁珠 | Sigma | M8823 | |
| Protein G Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| 3×FLAG多肽 | Sigma | F4799 | |
| Western blotting | 抗SOX2抗体 | R&D | MAB2018 |
| 抗KLF4抗体 | R&D | AF3158 | |
| 抗OCT3/4抗体 | Santa Cruz | sc-8628 | |
| 抗c-MYC抗体 | R&D | AF3696 | |
| 抗NIPBL抗体 | BETHYL | A301-779A | |
| 抗MED1抗体 | BETHYL | A300-793 | |
| 抗MED12抗体 | BETHYL | A300-774 | |
| 抗SMC1A抗体 | BETHYL | A300-055 | |
| 抗CDK9抗体 | Santa Cruz | sc-484 | |
| 抗p300抗体 | Santa Cruz | sc-585 | |
| 抗BRD4抗体 | BETHYL | A301-985A100 | |
| 抗RBBP5抗体 | BETHYL | A300-109A | |
| 抗RING1B抗体 | Cell Signaling Technology | 5694S | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗ACTIN抗体 | Sigma | A2066 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610181 | |
| 流式细胞术 | ICAM1-PE流式抗体 | eBiosciences | 12-0542 |
| ChIP | 双琥珀酰亚胺戊二酸酯 | Thermo Scientific | -- |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Santa Cruz | sc-899 | |
| 小鼠抗IgG抗体 | Beyotime | A7028 | |
| 山羊抗IgG抗体 | Beyotime | A7007 | |
| 兔抗IgG抗体 | Beyotime | A7016 | |
| ChIP-seq | Slide-A-Lyzer透析卡 | Thermo Scientific | 66380 |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库构建试剂盒 | Vazyme | TD502 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28004 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28104 | |
| VAHTSTM文库定量试剂盒 | Vazyme | NQ101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MEF重编程与JMJD3功能验证 | MEF代次（P2与P4）、Vc浓度（50 μg/ml）、感染方式（两轮24小时逆转录病毒感染）、集落计数时间（有Vc第11天，无Vc第16天）、n=3生物学独立实验 阅读提示：Methods 'iPSC generation and EpiSC-to-naïve PSC transition'及Fig. 1图注 |
| JMJD3催化活性验证 | JMJD3催化突变位点（T1385A/H1388A）、shJmjd3序列（Supplementary Data 2）、转染或感染条件、GFP+集落计数时间点 阅读提示：Methods 'Plasmids and molecular cloning'及Fig. 2图注 |
| KLF4与JMJD3协同验证 | KLF4高水平（正常病毒量）与低水平（1/5病毒量）的设定、OSM或OSK因子组合、GFP+集落计数时间（第14天）、n=3生物学独立实验 阅读提示：Fig. 4图注及Results 'KLF4 and JMJD3 cooperate to activate target genes' |
| ChIP-seq与RNA-seq实验 | H3K27me3 ChIP-seq的Drosophila S2 spike-in比例（2:1）、超声片段大小（150–300 bp）、RNA-seq测序平台（Illumina HiSeq 2500）、差异基因阈值（q<0.1，fold change>1.5） 阅读提示：Methods 'ChIP-qPCR and ChIP-seq'、'RNA-seq and analysis'及Supplementary Data 4 |
| 增强子-启动子成环与转录延伸验证 | 3C-PCR限制性内切酶选择（Sall1和Tdh用BamHI和BglII，Sall4用BamHI）、Nipbl敲低效率、Pol II ChIP-qPCR位点、n=3生物学独立实验 阅读提示：Methods '3C-PCR'及Fig. 6图注 |