细胞模型构建与PINCH-1功能缺失
在肺腺癌细胞中敲除或敲低PINCH-1，观察对线粒体形态和细胞增殖的影响。
利用CRISPR/Cas9在A549细胞中敲除PINCH-1，或在H1299细胞中用shRNA敲低PINCH-1，并通过Western blotting验证；采用MitoTracker染色、TEM和mtDNA定量分析线粒体碎片化，用Ki67染色和台盼蓝排除法检测细胞增殖。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PINCH-1调控线粒体动力学以促进脯氨酸合成和肿瘤生长
PINCH-1 regulates mitochondrial dynamics to promote proline synthesis and tumor growth.
实验完整度
高包含细胞模型、小鼠肺腺癌模型及患者组织芯片，进行功能验证与机制验证
主要模型
人A549肺腺癌细胞系 人H1299肺腺癌细胞系 KrasG12D诱导的小鼠肺腺癌模型
重点核对
PINCH-1敲除A549细胞中DRP1的mRNA和蛋白水平升高 PINCH-1敲除细胞中kindlin-2线粒体转位及其与PYCR1的复合物形成减少 敲低DRP1可逆转PINCH-1缺失引起的线粒体碎片化和增殖抑制 过表达PYCR1可恢复PINCH-1 KO细胞的脯氨酸合成和增殖 小鼠肺腺癌中敲除PINCH-1后DRP1升高、PYCR1和脯氨酸降低、肿瘤生长受抑
摘要
脯氨酸代谢的重编程对肿瘤生长至关重要。本文报道PINCH-1在肺腺癌中高表达，并通过调控线粒体动力学促进脯氨酸合成。PINCH-1的敲除（KO）增加动力相关蛋白1（DRP1）表达和线粒体碎片化，从而抑制kindlin-2的线粒体转位及其与吡咯啉-5-羧酸还原酶1（PYCR1）的相互作用，导致脯氨酸合成和细胞增殖受抑制。敲低DRP1可逆转PINCH-1缺失引起的线粒体动力学、脯氨酸合成和细胞增殖缺陷。此外，在PINCH-1 KO细胞中过表达PYCR1可恢复脯氨酸合成和细胞增殖，并抑制DRP1表达和线粒体碎片化。最后，在小鼠肺腺癌中敲除PINCH-1可增加DRP1表达并抑制PYCR1表达、脯氨酸合成、纤维化和肿瘤生长。我们的结果鉴定了一条由PINCH-1、DRP1和PYCR1组成的信号轴，该轴调控线粒体动力学和脯氨酸合成，并提示了一种缓解肿瘤生长的有吸引力的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PINCH-1如何调控线粒体动力学、PYCR1及脯氨酸合成，并影响肺腺癌生长？
- 核心机制
- PINCH-1通过抑制DRP1表达维持线粒体动力学，促进kindlin-2线粒体转位及其与PYCR1的复合物形成，从而稳定PYCR1并促进脯氨酸合成和肿瘤生长。
- 主要证据
- 在A549和H1299细胞中敲除或敲低PINCH-1，结合DRP1敲低、PYCR1过表达回复实验，以及KrasG12D小鼠肺腺癌模型中的PINCH-1敲除，验证了PINCH-1-DRP1-PYCR1信号轴。
- 研究意义
- 研究提示PINCH-1-DRP1-PYCR1轴可作为缓解肺腺癌肿瘤生长的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DRP1在PINCH-1调控线粒体碎片化中的作用验证
验证PINCH-1是否通过DRP1调控线粒体碎片化和细胞增殖。
在PINCH-1 KO A549细胞中转染DRP1 siRNA，检测DRP1蛋白和mRNA水平、线粒体形态及细胞增殖；同时检测PINCH-1缺失对MFF、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1等线粒体动力学蛋白的影响。
PINCH-1调控kindlin-2线粒体转位及PYCR1复合物形成
检测PINCH-1缺失对kindlin-2线粒体转位、kindlin-2与PYCR1相互作用及脯氨酸合成的影响。
采用亚细胞组分分离、免疫共沉淀和邻位连接实验（PLA）分析kindlin-2线粒体定位及其与PYCR1的复合物；用茚三酮法和UPLC-MS/MS测定脯氨酸水平；检测NADPH/NADP+比值和ROS水平。
DRP1敲低对kindlin-2-PYCR1轴及脯氨酸合成的回复验证
验证DRP1介导的线粒体碎片化是否影响kindlin-2线粒体转位、PYCR1水平和脯氨酸合成。
在PINCH-1 KO A549细胞中敲低DRP1，检测kindlin-2线粒体转位、kindlin-2-PYCR1复合物、PYCR1蛋白水平和脯氨酸含量；另在野生型A549细胞中过表达MFN2以抑制线粒体碎片化，检测kindlin-2-PYCR1复合物。
PYCR1过表达对PINCH-1缺失表型的回复验证
验证PYCR1水平降低是否介导PINCH-1缺失引起的脯氨酸合成和增殖抑制。
在PINCH-1 KO A549细胞中过表达3xFLAG-PYCR1，检测脯氨酸水平、细胞增殖、DRP1表达和线粒体形态。
小鼠肺腺癌模型中PINCH-1敲除的体内验证
在体内验证PINCH-1对DRP1、PYCR1、脯氨酸合成、胶原基质和肿瘤生长的影响。
将PINCH-1fl/fl小鼠与KrasLSL-G12D/+小鼠杂交，通过鼻内给予Ad-Cre诱导肺腺癌并敲除PINCH-1；16周后检测PINCH-1、DRP1、PYCR1表达，脯氨酸水平，胶原基质（SHG、Masson染色、IHC），细胞增殖（Ki67），肿瘤大小和生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | MaxVisionTM HRP-聚合物抗兔免疫组化试剂盒 | MXB biotechnologies | -- |
| 抗PINCH-1抗体 | Abcam | ab108609 | |
| 抗PYCR1抗体 | Proteintech | 13108-1-AP | |
| 抗DRP1抗体 | Proteintech | 12957-1-AP | |
| 抗Ki67抗体 | CST | 12202P | |
| 抗胶原1A1抗体 | Novus | NB600-408 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco-Invitrogen | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 台盼蓝排除实验 | 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 |
| 细胞-ECM黏附实验 | 胶原蛋白I | Corning | 354249 |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 纤连蛋白 | EMD Millipore | FC010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| RT-PCR | ReverTra® Ace qPCR逆转录预混液 | Toyobo Life Science | -- |
| SYBR® Premix Ex Taq™ II | -- | -- | |
| 亚细胞组分分离 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| Western blotting | 抗PINCH-1抗体 | Proteintech | 20772-1-AP |
| 抗ILK抗体 | CST | 3856S | |
| 抗α-Parvin抗体 | CST | 8190S | |
| 抗kindlin-2抗体 | Proteintech | 11453-1-AP | |
| 抗prohibitin-2抗体 | CST | 14085S | |
| 抗OPA1抗体 | Proteintech | 27733-1-AP | |
| 抗MFN1抗体 | Proteintech | 13798-1-AP | |
| 抗MFN2抗体 | Proteintech | 12186-1-AP | |
| 抗MFF抗体 | Proteintech | 17090-1-AP | |
| 抗FIS1抗体 | Proteintech | 10956-1-AP | |
| HRP标记小鼠抗微管蛋白抗体 | Proteintech | HRP-66031 | |
| HRP标记二抗兔IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 超敏ECL化学发光检测试剂 | 4A Biotech Co., Ltd. | 4AW011 | |
| 免疫荧光 | 抗COXIV抗体 | Proteintech | 66110-1-Ig |
| Alexa Flours标记抗兔或小鼠IgG二抗 | Invitrogen | -- | |
| 邻位连接实验 | DuoLink PLA技术探针和试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 小鼠抗kindlin-2抗体 | -- | 3A3.560 | |
| 小鼠抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Protein A/G PLUS琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 | |
| 无关小鼠IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| 活细胞成像 | MitoTracker Red CMXRos线粒体荧光探针 | Life Technologies | -- |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| NADPH/NADP检测 | NADPH/NADP定量试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK038 |
| ROS检测 | 二氢乙锭荧光探针 | Beyotime | -- |
| 脯氨酸测定 | 茚三酮 | -- | -- |
| 胶原基质分析 | 中性树胶 | Yeasen | 36313ES60 |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio Life Science | G1340 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肺腺癌模型构建与PINCH-1敲除 | 小鼠品系：KrasLSL-G12D/+与PINCH-1fl/fl杂交；Ad-Cre剂量3×10^7 pfu，分两次45μl鼻内滴入，间隔3分钟；小鼠年龄6-8周；感染后16周分析 阅读提示：Methods中“Mice”和“Ad-Cre infection of mouse lung”小节，以及Fig. 9和Fig. 10图注 |
| 细胞培养与基因敲除/敲低 | A549和H1299细胞系来源ATCC；PINCH-1 KO采用CRISPR/Cas9靶向exon 4；shRNA序列和siRNA转染浓度25 pmol/孔；慢病毒感染MOI=100，16小时，polybrene 8 μg/ml 阅读提示：Methods中“Cell culture, viral vector generation, and infection”、“Generation of PINCH-1 KO A549 cells”和“RNA interference”小节 |
| 线粒体形态分析 | MitoTracker Red CMXRos浓度50 nM，孵育30分钟；共聚焦显微镜63×油镜；TEM固定和染色步骤；线粒体形态分类标准（碎片化：长宽比≤1.5；中间型：1.5-3.0；延长型：>3） 阅读提示：Methods中“Live-cell imaging and analysis of mitochondrial morphology”和“Transmission electron microscopy (TEM)”小节 |
| 脯氨酸水平测定 | 细胞在无血清DMEM中培养24小时；茚三酮法：200μl上清与400μl 1.25%茚三酮反应，100°C 20分钟，508 nm读数；UPLC-MS/MS参数 阅读提示：Methods中“Measurement of proline level”小节 |
| Seahorse OCR分析 | 细胞密度2.5×10^4/孔；寡霉素1 μM、FCCP 1 μM、鱼藤酮0.5 μM、抗霉素A 0.5 μM；XF DMEM Base Medium补充1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酰胺、10 mM葡萄糖 阅读提示：Methods中“Analyses of cellular oxygen consumption rate (OCR)”小节 |