NSs在细胞中形成核纤维
验证NSs是否在多种细胞系中形成核纤维
用wt RVFV感染十种细胞系，免疫荧光和共聚焦显微镜观察NSs纤维。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NSs淀粉样蛋白形成与裂谷热病毒在小鼠中的毒力相关
NSs amyloid formation is associated with the virulence of Rift Valley fever virus in mice.
实验完整度
高包含细胞系、小鼠模型及多种显微和生化验证，并有功能验证。
主要模型
Vero细胞 HeLa细胞 A549细胞 BALB/c小鼠
重点核对
细胞系：Vero、HeLa、A549等，MOI~5感染16小时 小鼠：BALB/cByJ，9周龄雄性，腹腔或颅内接种100 pfu NSs突变体：C39S/C40S、C149S、C178S、C194S Thioflavin-S染色和SDD-AGE分析
摘要
淀粉样纤维由宿主细胞编码的蛋白质聚集形成，其中许多会导致特定的人类疾病，如阿尔茨海默病。本文中，我们展示了裂谷热病毒的主要毒力因子NSs蛋白在小鼠大脑中形成纤维状结构并影响死亡率。NSs在感染细胞中组装成依赖二硫键的核内和胞质纤维状聚集体。NSs的结构排列表现出淀粉样蛋白的典型特征，如12纳米宽纤维的超微结构、强去垢剂抗性以及与淀粉样蛋白结合染料Thioflavin-S的相互作用。病毒淀粉样纤维的组装动态可以实时可视化。它们在5小时内自发形成并以淀粉样蛋白的方式生长。总之，我们的结果表明病毒可以编码淀粉样纤维形成蛋白，并对未来关于淀粉样蛋白聚集和毒性的一般研究具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NSs蛋白是否形成淀粉样纤维并导致裂谷热病毒神经病理和毒力？
- 核心机制
- NSs组装成依赖二硫键的淀粉样纤维，通过形成短纤维抑制IFN反应并导致神经病理。
- 主要证据
- 细胞和小鼠模型中NSs形成纤维，ThS结合和去垢剂抗性，突变体功能分析。
- 研究意义
- 证明病毒可编码淀粉样纤维形成蛋白，对淀粉样蛋白研究有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NSs纤维的超微结构分析
确定NSs纤维的淀粉样性质
STED、TEM和CLEM观察NSs纤维的形态和尺寸。
NSs聚集体的淀粉样性质检测
验证NSs聚集体是否具有淀粉样特性
ThS染色和去垢剂溶解度实验。
NSs纤维化依赖特定半胱氨酸
确定哪些半胱氨酸残基参与纤维形成
构建半胱氨酸点突变病毒，感染细胞并观察聚集体形态。
NSs纤维在淀粉样 fashion 中生长
分析NSs聚集的动态
固定细胞和时间序列显微镜观察聚集体数量和大小变化。
胞质NSs聚集体由短纤维组成
确定胞质聚集体的超微结构
STED和TEM观察胞质聚集体。
NSs单独形成淀粉样纤维
验证NSs是否在没有其他病毒蛋白时形成纤维
转染NSs表达质粒，观察聚集体。
NSs纤维抑制IFN反应
确定NSs结构对IFN抑制的影响
用突变体病毒感染细胞，检测IFN-β mRNA和PKR蛋白。
NSs在感染小鼠脑中形成纤维
验证NSs在体内形成淀粉样纤维
小鼠腹腔接种RVFV，免疫组化和ThS染色脑组织。
NSs导致神经疾病和死亡
评估NSs对神经毒力的贡献
小鼠颅内接种RVFV或ΔNSs，监测生存和病毒复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Thermo Fisher Scientific产品 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ThS染色 | 硫黄素S | Sigma Aldrich | -- |
| 免疫印迹 | 抗PKR兔多克隆抗体 | Proteintech | 18244-1-AP |
| 抗α-微管蛋白单克隆抗体B512 | Sigma Aldrich | -- | |
| 抗β-肌动蛋白单克隆抗体AC74 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | SsoAdvanced SYBR green | BioRad | -- |
| iSCRIPT逆转录酶 | BioRad | -- | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| 核分离 | Nuclei EZ Prep试剂盒 | Sigma Aldrich | -- |
| 超声破碎 | Bioruptor Plus超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| 免疫印迹 | Nu-PAGE Novex 10% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| iBlot转膜栈 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SuperSignal | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ECF | GE Healthcare Life Science | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞感染 | MOI和感染时间：MOI ~5，感染后16小时；不同实验有变化 阅读提示：Methods: Cell infection和Figure legends |
| 小鼠感染 | 接种剂量和途径：腹腔100 pfu或颅内10-100 pfu；小鼠年龄和性别：9周龄雄性BALB/cByJ 阅读提示：Methods: Mouse infection |
| ThS染色 | ThS浓度：0.05%用于细胞，1%用于组织；透化条件 阅读提示：Methods: Confocal spinning-disc microscopy和Imaging of mouse brain tissues |
| SDD-AGE | SDS浓度：2%，温度：22-95°C，DTT浓度：10 mM 阅读提示：Methods: Protein analysis |