TECPR1与LC3C选择性结合验证
验证TECPR1是否选择性结合LC3C而非其他hATG8。
在TECPR1KO HeLa细胞中共表达MycBioID-TECPR1与HA标记hATG8s进行BioID，并用GFP-TECPR1进行co-IP；统计GFP-hATG8点状结构数量。
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TECPR1通过将LC3C自噬体直接募集到溶酶体促进聚集物自噬
TECPR1 promotes aggrephagy by direct recruitment of LC3C autophagosomes to lysosomes.
实验完整度
高包含HeLa细胞、神经干细胞体外模型、纯化蛋白体外重构、CRISPR敲除、CLEM及多种功能验证
主要模型
HeLa细胞 人神经干细胞（H9来源） 纯化蛋白-脂质体体外重构体系
重点核对
TECPR1与LC3C选择性结合：BioID和co-IP验证 TECPR1的TR1结构域和LIR基序（W175AKI178）介导LC3C结合 PH结构域选择性结合PtdIns(4)P，靶向溶酶体 TECPR1过表达促进神经干细胞中Ub和HttQ97聚集物清除，BafA1抑制自噬可阻断 LC3C敲低导致神经干细胞中Ub聚集物积累
摘要
蛋白质聚集物的积累参与许多神经退行性疾病的发生。聚集物自噬是一种选择性自噬类型，通过降解此类聚集物来对抗神经退行性变。在本研究中，我们发现LC3C与溶酶体TECPR1协同促进神经干细胞中疾病相关蛋白质聚集物的降解。TECPR1的N端WD重复结构域选择性结合修饰成熟自噬体的LC3C。LC3C与TECPR1的相互作用促进自噬体募集至溶酶体进行降解。在神经干细胞中增加TECPR1表达通过促进蛋白质聚集物的自噬清除减少其数量，而敲低LC3C则抑制聚集物自噬。TECPR1的PH结构域选择性结合PtdIns(4)P，将TECPR1靶向至含PtdIns(4)P的溶酶体。将PH结构域替换为串联FYVE结构域使TECPR1异位靶向至内体。这导致LC3C自噬体在内体积累并阻止其向溶酶体递送。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TECPR1在自噬晚期步骤中的分子功能是什么，以及它如何促进蛋白质聚集物的清除。
- 核心机制
- TECPR1的N端TR1结构域和LIR基序选择性结合LC3C，PH结构域结合PtdIns(4)P将TECPR1靶向溶酶体，从而将LC3C自噬体募集至溶酶体进行融合降解。
- 主要证据
- 在HeLa细胞和神经干细胞中通过BioID、co-IP、共定位、CLEM、体外脂质体重构、敲除/敲低及聚集物清除实验，证明TECPR1与LC3C协同促进聚集物自噬。
- 研究意义
- 揭示了TECPR1和LC3C是神经细胞中促进聚集物自噬的关键组分，其表达增强可能对抗神经退行性疾病的发生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TECPR1结构域与LIR基序功能鉴定
确定TECPR1中负责LC3C结合和溶酶体定位的结构域及基序。
表达TR1、TR2、TECPR1ΔAIR、TECPR1ΔPH及LIR突变体（W175A/I178A），通过共定位、SUVs漂浮实验和BioID分析相互作用。
TECPR1募集LC3C囊泡至溶酶体的体外重构
验证TECPR1能否在体外将LC3C囊泡募集至膜结构。
将Alexa488标记的LC3C偶联至SUVs，TECPR1装饰GUVs，共孵育后观察LC3C-SUVs在TECPR1-GUVs上的聚集。
TECPR1 PH结构域脂质结合特异性鉴定
确定PH结构域结合哪种磷酸肌醇并介导溶酶体靶向。
用含不同PtdInsP的GUVs与纯化TECPR1孵育，并在细胞中检测TECPR1与PtdIns(4)P的共定位；敲低PI4KIIα或OCRL，过表达Sac2。
TECPR1决定LC3C自噬体亚细胞去向
验证TECPR1定位是否决定LC3C囊泡的目的地。
构建TECPR1ΔPH-2xFYVE异位靶向内体，检测其与EEA1、LC3C及其他hATG8s的共定位，以及LIR突变体的影响。
神经干细胞中聚集物清除功能验证
验证TECPR1和LC3C在神经干细胞中对蛋白质聚集物清除的作用。
在NSCs中过表达TECPR1或TECPR1ΔPH-2xFYVE，用puromycin诱导聚集物，siRNA敲低LC3C或hATG8s，免疫染色检测Ub和p62点状结构；表达HttQ97并检测聚集物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 31966-021 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| StemPro培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Geltrex基质胶 | ThermoFisher scientific | 12063569 | |
| Earle平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | E2888 | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 巴弗洛霉素A1 | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| 渥曼青霉素 | Sigma | W1628 | |
| SAR405 | Clinisciences | A8883-1ml | |
| MG132 | -- | -- | |
| 活细胞成像 | LysoTracker深红 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 转染 | TransIT-HeLaMONSTER转染试剂盒 | Mirus | MIR2904 |
| TransIT-293转染试剂 | Mirus | MIR2704 | |
| siRNA敲低 | Silencer siRNA | Invitrogen | 4427037 |
| BioID | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | 65001 |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | ThermoScientific | 21130 | |
| 免疫共沉淀 | GFP Trap磁珠 | CHROMOTEK | gtma-20 |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | -- |
| Superdex 75 | -- | -- | |
| Superdex 200柱 | -- | -- | |
| 荧光标记 | Alexa Fluor 488 C5马来酰亚胺 | Molecular Probes | -- |
| CF405 M | Biotium | -- | |
| HiTrap脱盐柱 | GE Healthcare | -- | |
| SDS-PAGE | NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶 | Novex | -- |
| 免疫细胞化学 | Alexa Fluor二抗 | Molecular Probes | -- |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 蛋白纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8849 |
| Benzonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PreScission蛋白酶 | -- | -- | |
| CLEM | TetraSpeck微球 | Invitrogen | -- |
| 免疫细胞化学 | 抗HA抗体 | Santa Cruz | sc-7392 |
| 免疫印迹 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Invitrogen | MA1-140 |
| 免疫细胞化学 | 抗LAMP2抗体 | Santa Cruz | sc-18822 |
| 抗LAMP1抗体 | CST | 9091 | |
| 抗LC3抗体 | MBL International | M152-3 | |
| 抗p62抗体 | BD Biosciences | 610833 | |
| 抗STX17抗体 | GeneTex | GTX130212 | |
| 抗EEA1抗体 | CST | 3288 | |
| 抗Rab5抗体 | CST | 3547 | |
| 抗Rab7抗体 | CST | 9367 | |
| 抗Rab11A抗体 | Invitrogen | 700184 | |
| 抗泛素抗体 | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | |
| 抗Hsp60抗体 | CST | 12165 | |
| 抗PMP70抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200181 | |
| 免疫印迹 | 抗EGFR抗体 | Santa Cruz | sc-03-G |
| 免疫细胞化学 | 抗PtdIns(4)P抗体 | Echelon | Z-P004 |
| 免疫印迹 | 抗GFP抗体 | Invitrogen | A-6455 |
| 抗myc抗体 | Biochemistry core facility, MPI of Biochemistry, Martinsried | 9E10 | |
| 免疫细胞化学 | 抗PtdIns(4,5)P2抗体 | Echelon | Z-P045 |
| 免疫印迹 | 抗HA抗体 | CST | 3724 |
| 脂质体制备 | 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 胆固醇 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇-3′-磷酸 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇-3′,5′-二磷酸 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇-4′-磷酸 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 定点突变 | QuikChange Lightning定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HeLa细胞来源（Cell Lines Service #300194）；NSCs来源（ThermoFisher #N7800，H9来源）；puromycin 5 μg/ml处理2小时；BafA1 400 nM处理4小时；wortmannin 1.5 mM处理4小时；SAR405 10 μM处理2小时；siRNA 10 nM处理48小时 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection小节 |
| TECPR1与LC3C结合验证 | TECPR1KO HeLa细胞；BioID使用50 μM biotin，转染后24小时裂解；co-IP使用GFP Trap磁珠过夜4°C；统计n=47个细胞，三次独立实验 阅读提示：Methods中BioID analysis和Co-immunoprecipitation assays小节；Fig. 1a-c图注 |
| 体外脂质体结合与漂浮实验 | SUVs脂质组成（DOPC 59.9 mol%、DOPE 40 mol%、lissamine-rhodamine-PE 0.1 mol%）；GUVs脂质组成（POPC 36.9 mol%、DOPE 30 mol%、胆固醇20 mol%、POPS 10 mol%、PtdInsPs 3 mol%、lissamine-rhodamine-PE 0.1 mol%）；TECPR1 1 μM，37°C 30分钟；蛋白化学计量ATG7:ATG3:hATG8:ATG12–ATG5 = 1:1.5:6:0.5 阅读提示：Methods中Floatation assay和PtdInsP binding assay小节；Fig. 2c、Fig. 4b图注 |
| 神经干细胞聚集物清除实验 | NSCs培养于StemPro培养基含FGF-2 10 ng/ml和EGF 10 ng/ml；Geltrex包被；puromycin 5 μg/ml处理2小时诱导聚集物；BafA1 400 nM处理4小时；HttQ97与TECPR1共表达；Ub点状结构统计n=70个细胞，四次独立实验 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection小节；Fig. 7图注 |
| 蛋白酶K保护实验 | GFP-LC3C转染HeLa细胞；Proteinase K 100 μg/ml；Triton X-100 0.5%；反应时间文中未明确说明具体时长（图中指示时间）；三次独立实验 阅读提示：Methods中Proteinase K protection assay小节；Fig. 6d图注 |