鉴定BRME1为MEILB2相互作用蛋白
筛选与MEILB2结合的减数分裂特异性蛋白
酵母双杂交筛选小鼠睾丸cDNA文库，鉴定4930432K21Rik基因产物并命名为BRME1；RT-PCR检测组织表达；Y2H和FLAG pulldown验证BRME1-MBD与MEILB2相互作用。
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BRCA2-MEILB2-BRME1复合体调控减数分裂重组并在癌细胞中削弱有丝分裂BRCA2-RAD51功能
The BRCA2-MEILB2-BRME1 complex governs meiotic recombination and impairs the mitotic BRCA2-RAD51 function in cancer cells.
实验完整度
高含体外重组蛋白生化、小鼠基因敲除体内遗传、细胞系功能及癌症样本表达分析，并完成功能与机制验证。
主要模型
Brme1−/−、Meilb2−/−、Spo11−/−、Dmc1−/−、Meiob−/−小鼠精母细胞 小鼠B16-F1细胞系 人U2OS-DSB报告细胞系 小鼠睾丸组织提取物
重点核对
Brme1−/−小鼠基因型鉴定及BRME1 foci缺失确认 MEILB2 foci强度和数量在Brme1−/−精母细胞中的定量 RAD51、DMC1、RPA2、γH2AX foci在Brme1−/−精母细胞中的动态定量 MEILB2-R204T突变对BRCA2结合及有丝分裂DSB定位的影响 MMC处理及U2OS-DSB报告系统中RAD51聚集的定量
摘要
乳腺癌易感基因II（BRCA2）在同源重组（HR）中处于核心地位。在减数分裂中，BRCA2与MEILB2结合以定位到DNA双链断裂（DSB）处。在本研究中，我们鉴定出BRCA2和MEILB2关联蛋白1（BRME1），它通过结合MEILB2的α螺旋N端并阻止MEILB2自我关联，发挥稳定MEILB2的作用。BRCA2结合于MEILB2的C端，从而形成BRCA2-MEILB2-BRME1三元复合体。在Brme1基因敲除（Brme1−/−）小鼠中，BRCA2-MEILB2复合体失稳，导致DSB修复、同源染色体联会和交叉形成缺陷。Brme1−/−中持续存在的DSB重新激活了体细胞样DNA损伤应答，该应答能修复DSB但无法弥补交叉形成缺陷。此外，MEILB2-BRME1在多种人类癌症中被激活，体细胞表达的MEILB2-BRME1削弱了有丝分裂HR。因此，减数分裂BRCA2复合体在减数分裂HR中处于核心地位，其调控异常与癌症发生相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRCA2如何在减数分裂中转换为减数分裂特异性功能，以及BRME1在减数分裂HR和有丝分裂中的角色是什么？
- 核心机制
- BRME1结合MEILB2的α1螺旋N端并阻止其自我关联，从而稳定MEILB2；BRCA2结合MEILB2 C端形成三元复合体；该复合体通过SPATA22-MEIOB招募到ssDNA并促进重组酶装载。
- 主要证据
- 体外重组蛋白纯化、SEC-MALS、CD、SAXS和Y2H证实三元复合体及BRME1稳定MEILB2；Brme1−/−小鼠精母细胞免疫染色显示DSB修复、联会和交叉形成缺陷；B16-F1和U2OS-DSB报告细胞证实MEILB2-BRME1抑制有丝分裂HR。
- 研究意义
- 减数分裂BRCA2复合体在减数分裂HR中处于核心地位，其调控异常（MEILB2-BRME1在人类癌症中激活并削弱有丝分裂HR）与癌症发生相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外重构BRCA2-MEILB2-BRME1三元复合体
验证三元复合体的形成及BRME1对MEILB2的稳定机制
大肠杆菌共表达纯化MEILB2 C端与BRCA2-MBD，SEC-MALS测定分子量；纯化MEILB2 α1+2与BRME1-MBD，CD测热稳定性，SEC-MALS和SEC-SAXS分析寡聚状态和形状；细胞GFP pulldown验证三元复合体。
验证减数分裂BRCA2复合体与SPATA22-MEIOB及RAD51的相互作用
确定体内复合体组成及与下游因子的关联
小鼠睾丸提取物BRME1和BRCA2免疫共沉淀，半定量质谱和免疫印迹检测BRCA2、MEILB2、SPATA22-MEIOB、RAD51、DMC1。
BRME1定位依赖MEILB2并受SPATA22-MEIOB促进
解析BRME1在减数分裂DSB上的定位机制
免疫染色WT、Meilb2−/−、Spo11−/−、Dmc1−/−、Meiob−/−精母细胞中BRME1、MEILB2、RPA2 foci；体内电穿孔表达GFP-BRME1截短体检测定位。
Brme1敲除小鼠表型及减数分裂缺陷分析
确定BRME1在体内的功能
CRISPR/Cas9构建Brme1−/−小鼠，组织学、TUNEL、免疫染色分析睾丸形态、MEILB2/BRCA2/RAD51/DMC1/RPA2/γH2AX foci、联会（SYCE3/SYCP3）和交叉（MLH1、单价体）。
MEILB2-BRME1抑制有丝分裂HR
探究MEILB2-BRME1在体细胞中的功能
B16-F1细胞过表达MEILB2或BRME1，MMC处理诱导DSB，免疫染色RAD51 foci；U2OS-DSB报告细胞系诱导单DSB，检测RAD51聚集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
分析蛋白结构与稳定性
验证减数分裂表型
验证有丝分裂HR功能
分析基因表达
质谱分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| sgRNA制备 | MEGAshortscript试剂盒 | Ambion | AM1354 |
| 小鼠受精卵注射 | SpCas9蛋白 | Sigma | -- |
| TUNEL检测 | ApopTag Plus原位凋亡荧光检测试剂盒 | Millipore | S 7111 |
| 免疫印迹 | 抗GFP抗体 | Invitrogen | A11122 |
| 抗DMC1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-22768 | |
| 抗RAD51抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-27195 | |
| 抗SPATA22抗体 | Proteintech Group Inc | 16989-1-AP | |
| 抗MEIOB抗体 | EMD Millipore | ABE1414 | |
| 抗β-ACTIN抗体 | Sigma | A2228-100UL | |
| 抗MLH1抗体 | BD Biosciences | 51-1327GR | |
| 抗γH2AX抗体 | EMD Millipore | 05-636 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804-50UG | |
| 抗MYC抗体 | MBL | M192-3 | |
| 抗RPA2抗体 | Cell signaling technology | 2208 | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱分析 | HiPPR去污剂去除树脂试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | PN 88305 |
| Pierce肽脱盐离心柱 | Thermo Fisher Scientific | PN 89851 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 下拉实验 | GFP-trap磁性琼脂糖 | Chromotek | -- |
| Myc-trap磁性琼脂糖 | Chromotek | -- | |
| 抗FLAG M2磁性珠子 | Sigma | -- | |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | Qiagen | -- |
| Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiTrap SP阳离子交换柱 | GE Healthcare | -- | |
| SEC-MALS分析 | DAWN HELEOS II多角度光散射检测器 | Wyatt Technology | -- |
| Optilab T-rEX示差折光仪 | Wyatt Technology | -- | |
| CD光谱 | Jasco J-810旋光仪 | Jasco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Brme1敲除小鼠构建 | sgRNA靶向exon 7/8序列、SpCas9浓度30 ng/μl、sgRNA浓度12.5 ng/μl、受精卵背景C57BL/6J 阅读提示：Methods中“Preparation of sgRNA for Brme1−/− mice”和“Generation of Brme1−/− mice”小节 |
| 精母细胞免疫染色 | 细胞铺片固定条件、一抗稀释度（文中未明确说明）、二抗Alexa Fluor 488/594/647 1:1000 阅读提示：Methods中“Immunostaining of spermatocytes”小节 |
| 体内电穿孔表达 | 小鼠日龄PD16–30、质粒浓度5 μg/μl、注射体积10 μl、电脉冲35 V/50 ms各4次 阅读提示：Methods中“Exogenous protein expression in the testis”小节 |
| 免疫共沉淀 | 抗体用量80 μg、孵育6 h 4°C、高盐洗涤缓冲液组成 阅读提示：Methods中“Preparation of testis extract and immunoprecipitation”小节 |
| 有丝分裂HR抑制实验 | B16-F1细胞MMC过夜处理浓度（文中未明确说明）、U2OS-DSB诱导1 μM 4-OHT和1 μM Shield-1处理8 h 阅读提示：Methods中“Cell culture”小节和Fig. 8图注 |
| SEC-MALS分析 | 上样量500 μg、流速0.5 ml/min、dn/dc值0.185 ml/g 阅读提示：Methods中“SEC-MALS for the BRCA2-MEILB2 complex”和“SEC-MALS for the MEILB2-BRME1 complex”小节 |