筛选内质网应激响应的TRIM家族基因
鉴定在内质网应激下表达改变的TRIM家族成员
用TM或TG处理HCT116细胞，通过实时PCR检测所有TRIM基因的mRNA水平。
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TRIM25通过靶向Keap1-Nrf2通路促进肝细胞癌细胞的存活和生长
TRIM25 promotes the cell survival and growth of hepatocellular carcinoma through targeting Keap1-Nrf2 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物异种移植模型和患者组织样本，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HCT116结肠癌细胞系 Huh7肝细胞癌细胞系 U2OS骨肉瘤细胞系 裸鼠Huh7细胞皮下异种移植模型
重点核对
TM (5 μg/ml) 或 TG (1 μM) 处理时间（6 h、12 h） TRIM25稳定敲低或过表达的细胞系构建及验证 裸鼠皮下注射2.0×10^6细胞/只，每组8只 Keap1泛素化位点K615R突变验证 Nrf2敲低对TRIM25保护作用的逆转实验
摘要
肿瘤细胞在不利条件下常表现出维持内质网（ER）稳态的能力增强，但其潜在机制尚不明确。在此，通过对所有人类TRIM蛋白的评估，我们发现TRIM25在内质网应激时显著诱导。TRIM25的上调改善氧化应激，促进内质网相关降解（ERAD），并减少UPR通路中的IRE1信号。相反，TRIM25的缺失导致内质网应激并减弱肿瘤细胞在体外和体内的生长。机制上，TRIM25通过泛素化和降解直接靶向Keap1。这导致Nrf2激活，从而增强抗氧化防御和细胞存活。在肝细胞癌（HCC）异种移植瘤和标本中，TRIM25表达与Nrf2表达正相关，与Keap1表达负相关。此外，高TRIM25表达与HCC患者生存期差相关。这些发现揭示TRIM25是内质网稳态的调节因子和肿瘤治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM25如何在内质网应激下调节肿瘤细胞存活及其与Keap1-Nrf2通路的关系。
- 核心机制
- TRIM25作为E3泛素连接酶，直接泛素化Keap1并促进其降解，从而激活Nrf2信号，增强抗氧化防御并减少ROS。
- 主要证据
- 体外实验显示TRIM25过表达减少ROS、促进ERAD并抑制UPR；敲低TRIM25增加ROS和凋亡；裸鼠实验显示TRIM25敲低抑制肿瘤生长；HCC样本中TRIM25与Nrf2正相关、与Keap1负相关。
- 研究意义
- 揭示TRIM25是内质网稳态的调节因子，并可能作为肿瘤治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TRIM25对内质网应激和UPR的调控
明确TRIM25在ER应激下对UPR信号通路的影响
在HCT116、Huh7等细胞中敲低或过表达TRIM25，用TM或TG处理，检测UPR相关基因和蛋白。
评估TRIM25对ERAD和ROS的影响
探究TRIM25是否通过调节ROS影响ERAD活性
在HCT116细胞中检测CD3-δ-YFP降解，并用流式细胞术检测ROS水平。
鉴定TRIM25与Keap1的相互作用及泛素化
明确TRIM25是否直接靶向Keap1并促进其泛素化降解
通过Co-IP、GST pull-down和质谱鉴定相互作用，构建截短突变体和点突变体验证泛素化位点。
验证TRIM25对Nrf2核转位和转录活性的影响
确定TRIM25是否通过降解Keap1激活Nrf2信号
核质分离和免疫荧光检测Nrf2核转位，实时PCR检测Nrf2下游基因HO1和NQO1。
验证TRIM25对肿瘤细胞存活和凋亡的影响
明确TRIM25是否促进肿瘤细胞在ER应激下的存活
MTT检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，Western blot检测cleaved caspase-3。
体内验证TRIM25对HCC生长的影响
评估TRIM25敲低对HCC异种移植瘤生长和生存的影响
裸鼠皮下注射Huh7-shNC或Huh7-shTRIM25细胞，观察肿瘤生长和生存。
分析TRIM25与Keap1/Nrf2在HCC样本中的相关性及预后
探讨TRIM25表达的临床意义
免疫组化检测90例HCC患者样本中TRIM25、Keap1、Nrf2表达，并进行生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 衣霉素 | Sigma | -- |
| 毒胡萝卜素 | Sigma | -- | |
| ROS检测 | 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Sigma | -- |
| 免疫印迹 | BiP抗体 | Cell Signaling Technology | 3183 |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 磷酸化SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Keap1抗体 | Cell Signaling Technology | 4678 | |
| Flag M2抗体 | Sigma | F3165 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma | T6074 | |
| GFP抗体 | MBL | M048-3 | |
| His抗体 | MBL | D291-3 | |
| HA抗体 | Thermo Fisher Scientific | 71-5500 | |
| TRIM25抗体 | Novus Biologicals | NBP2-20710 | |
| Nrf2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365949 | |
| KEAP1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| Nrf2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 免疫组化 | TRIM25多克隆抗体 | Abclonal | A12938 |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 |
| 驴抗小鼠IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-10037 | |
| 免疫印迹 | 抗兔IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 |
| 抗小鼠IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | TM (5 μg/ml) 或 TG (1 μM) 处理时间（6 h、12 h） 阅读提示：Methods: Cell culture and stable cell lines; Figure legends Fig. 1-5 |
| TRIM25敲低/过表达 | shRNA序列（TRCN0000272697, TRCN0000272699）和过表达质粒 阅读提示：Methods: Plasmids and reagents |
| 动物实验 | 细胞注射数量（2.0×10^6细胞/只）、小鼠品系（BALB/c nude）、每组8只 阅读提示：Methods: Tumor xenograft mouse models; Figure legend Fig. 6 |
| 免疫组化 | 抗体稀释比例（1:200）和评分标准 阅读提示：Methods: Clinical samples and immunohistochemistry; Figure legend Fig. 6, 7 |
| 泛素化实验 | MG132 (4 μM) 和 CQ (50 μM) 处理浓度及时间 阅读提示：Figure legend Fig. 3i |