细胞系EMT诱导与标记物验证
筛选对TGFβ响应且发生EMT的肺癌细胞系
用TGFβ处理HCC827、A549、H3255细胞，通过免疫印迹和共聚焦显微镜检测EMT标记物（E-Cadherin、Vimentin、CD44）表达和形态变化。
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单细胞分辨率下绘制肺癌上皮-间质转化状态与轨迹
Mapping lung cancer epithelial-mesenchymal transition states and trajectories with single-cell resolution.
实验完整度
高基于三种NSCLC细胞系体外TGFβ时间进程质谱流式分析，结合计算建模和五种临床样本验证，包含功能与机制验证。
主要模型
HCC827非小细胞肺癌细胞系 A549非小细胞肺癌细胞系 H3255非小细胞肺癌细胞系 五例NSCLC腺癌临床样本
重点核对
TGFβ处理浓度5 ng/mL，处理时间长达10天，撤除后观察MET 质谱流式检测28种标记物，包括EMT标记和信号分子 CCAST聚类基于六个标记物（E-Cadherin、Vimentin、CD44、CD24、MUC1、Twist）识别八个状态 临床样本解离后使用抗体Panel区分免疫、内皮和基质细胞 神经网算法将独立样本投影到PHENOSTAMP，用已知细胞系验证
摘要
阐明临床样本中上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）状态谱有望为癌症进展和耐药性提供见解。利用质谱流式时间进程分析，我们解析了肺癌细胞经TGFβ处理后的EMT状态，并通过TGFβ撤除鉴定出一个独特的MET状态。我们使用计算工具（TRACER）重建细胞状态间的轨迹，证明EMT和MET轨迹之间存在显著差异。此外，我们构建了肺癌EMT和MET状态的参考图谱，称为EMT-MET表型状态图谱（PHENOSTAMP）。利用神经网络算法，我们将临床样本投影到EMT-MET PHENOSTAMP上，以单细胞分辨率根据我们的体外EMT-MET分析表征其表型特征。总之，我们提供了一个框架，可在体外EMT-MET发现的背景下对临床样本进行表型表征，这可能有助于未来研究评估EMT在癌症中的临床相关性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在单细胞分辨率下阐明肺癌临床样本中的EMT和MET状态谱，并将其与体外确定的EMT-MET状态相联系？
- 核心机制
- TGFβ诱导肺癌细胞发生EMT，撤除后部分细胞通过不同于EMT的轨迹发生MET，表现为滞后现象；计算分析识别出八个EMT/MET状态，并构建PHENOSTAMP用于映射临床样本。
- 主要证据
- 通过质谱流式时间进程分析HCC827等细胞系，利用CCAST聚类定义八个状态；TRACER分析显示EMT和MET轨迹差异；神经网络将五种临床样本投影到PHENOSTAMP，显示不同EMT状态分布。
- 研究意义
- 提供了一个框架，可在体外EMT-MET发现背景下对临床样本进行表型表征，有助于未来研究评估EMT在癌症中的临床相关性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱流式时间进程分析
在高维度单细胞水平表征EMT和MET过程中的状态变化
对HCC827细胞进行TGFβ处理10天及撤除后时间进程分析，使用28种标记物的质谱流式检测，并在每个时间点重新接种以保持汇合度。
计算聚类识别EMT/MET状态
无监督聚类定义离散的EMT和MET状态
对质谱流式数据使用CCAST算法，基于六个聚类标记物（E-Cadherin、Vimentin、CD44、CD24、MUC1、Twist）进行聚类，识别出八个状态。
轨迹分析（TRACER）
比较EMT和MET轨迹，检验滞后现象
开发并应用TRACER算法，基于马尔可夫过程假设，通过bootstrap分析估计状态转移概率，比较EMT和MET轨迹。
构建EMT-MET PHENOSTAMP
构建二维参考图谱用于映射样本的EMT/MET状态
使用t-SNE降维，结合Voronoi和凸包分析对八个状态进行分割，构建PHENOSTAMP。
神经网络投影临床样本
将独立样本和临床样本投影到PHENOSTAMP，以单细胞分辨率表征EMT/MET状态
训练单层隐藏神经网络，以六个标记物表达值为输入预测二维t-SNE坐标，投影细胞系和五例临床样本。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| EMT诱导 | 转化生长因子β | R&D | 240-B/CF |
| 免疫印迹 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| E-钙粘蛋白抗体 | BD | 610181 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| CD44抗体 | CST | 3570 | |
| Zeb抗体 | CST | 3396 | |
| Slug抗体 | CST | 9585 | |
| Twist抗体 | GeneTex | GTX127310 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| 共聚焦显微镜 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| Alexa 488波形蛋白抗体 | BD | 562338 | |
| Alexa 647 E-钙粘蛋白抗体 | BD | 324112 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Molecular Probes | P36935 | |
| 流式细胞术 | TrypLE解离酶 | Life technologies | 12605-010 |
| LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | L23105 | |
| PE/Cy7 E-钙粘蛋白抗体 | BioLegend | 324115 | |
| Alexa 488波形蛋白抗体 | BD | 562338 | |
| Pacific Blue CD44抗体 | BioLegend | 103019 | |
| APC/Cy7 CD24抗体 | BioLegend | 311131 | |
| Alexa 647 Twist抗体 | Bioss | bs-2441R | |
| 质谱流式 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | P4394 |
| MaxPar抗体偶联试剂盒 | Fluidigm | -- | |
| 191Ir/193Ir MaxPar核酸嵌入剂 | Fluidigm | -- | |
| EQ校准微球 | Fluidigm | -- | |
| CyTOF 2质谱流式仪 | Fluidigm | -- | |
| 临床样本处理 | MACS组织保存液 | Miltenyi | 130-095-929 |
| MACS肿瘤组织解离试剂盒 | Miltenyi | 130-095-929 | |
| MACS SmartStrainer（70微米） | Miltenyi | 130093237 | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi | 130094183 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系EMT诱导 | TGFβ浓度5 ng/mL，处理时间及撤除时间点，细胞接种密度和重新接种策略 阅读提示：Methods 'EMT induction in NSCLC cell lines'；Figure 1a, 1c |
| 质谱流式分析 | 28种标记物Panel组成，抗体克隆和金属同位素标记，样品钯条码和染色方案 阅读提示：Methods 'Mass cytometry antibodies', 'Mass-tag barcoding and antibody staining for mass cytometry'；Supplementary Table 1 |
| 临床样本处理 | 五例NSCLC腺癌样本的突变状态和分化等级，肿瘤解离和单细胞悬液制备流程，抗体Panel追加CD45、CD31、FAP 阅读提示：Methods 'Tumor dissociation and processing for mass cytometry'；Supplementary Table 4；Figure 6 |
| 计算聚类 | CCAST聚类标记物选择，聚类细胞数约96,000，状态阈值≥1% 阅读提示：Methods 'CCAST clustering'；Supplementary Fig. 5, 6 |
| 神经网络投影 | 神经网络结构（隐藏节点11），训练集和测试集比例，交叉验证方法 阅读提示：Methods 'Neural network for projecting onto the EMT–MET PHENOSTAMP' |