KRAS邻近蛋白组图谱构建
探究SNORD50A/B是否改变KRAS邻近蛋白组成
在3种人癌细胞系（H23、A549、CHL1）的SNORD50A/B WT与KO细胞中表达HA-BirA*-KRAS，加生物素标记后进行链霉亲和素pull-down与质谱鉴定KRAS邻近蛋白
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小非编码RNA与SNARE蛋白对KRAS的调控
KRAS regulation by small non-coding RNAs and SNARE proteins.
实验完整度
高包含邻近蛋白标记质谱、PLA、共免疫沉淀、远西印迹、MST、CLIP、RNA-seq及多种体内移植瘤模型，兼具功能与机制验证
主要模型
H23、A549、CHL1等KRAS突变人癌细胞系 SNORD50A/B野生型与敲除细胞 SNARE三基因敲除（TKO）细胞 免疫缺陷小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
SNORD50A/B WT与KO细胞中BirA*-KRAS邻近蛋白标记质谱的SAINT评分与倍数变化阈值 KRAS与SNAP23、SNAP29、VAMP3相互作用的PLA、共免疫沉淀与远西印迹验证 MST测定的KRAS与SNORD50A/B RNA及SNAP23/SNAP29的结合亲和力及RNA竞争 SNARE TKO后KRAS在回收内体（Arf6、Rab11）与质膜的定位变化 TCGA胰腺癌患者生存分析及小鼠皮下移植瘤中SNARE敲除对肿瘤生长的影响
摘要
KRAS在质膜（PM）上接收并传递信号，将细胞外生长因子信号传递至下游效应分子。近期研究发现SNORD50A/B可结合KRAS并通过未知机制抑制其致瘤作用。因此，本研究在SNORD50A/B野生型和敲除细胞中开展KRAS邻近蛋白标记，发现SNORD50A/B RNA塑造KRAS邻近蛋白的组成，尤其是通过抑制KRAS与SNARE囊泡运输蛋白SNAP23、SNAP29和VAMP3的邻近性。为维持质膜富集，KRAS经历内吞、增溶及囊泡运输至质膜的循环。本文报道SNARE是该过程最后一步所必需的，SNARE促进KRAS定位于质膜，而SNORD50A/B则拮抗这一过程。SNORD50A/B RNA与特定SNARE蛋白之间的拮抗控制KRAS定位、信号传导和肿瘤发生，破坏SNARE介导的KRAS功能可能为KRAS驱动癌症提供潜在治疗机会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SNORD50A/B RNA如何调控KRAS，以及SNARE囊泡运输蛋白在KRAS质膜定位、信号传导和肿瘤发生中的作用。
- 核心机制
- SNAP23、SNAP29和VAMP3等SNARE蛋白促进KRAS从回收内体运输至质膜，SNORD50A/B RNA与SNARE在KRAS相同氨基酸残基上竞争结合，从而拮抗SNARE介导的KRAS质膜富集与信号传导。
- 主要证据
- 在SNORD50A/B WT与KO细胞中的KRAS邻近蛋白标记质谱、PLA、共免疫沉淀、远西印迹、交联质谱、MST、CLIP、RNA-seq，以及SNARE TKO细胞的定位与信号分析和多种人癌细胞系的小鼠皮下移植瘤实验。
- 研究意义
- 揭示SNORD50A/B与SNARE对KRAS的拮抗调控机制，提示破坏SNARE介导的KRAS功能（如利用可切割SNAP23的肉毒毒素蛋白酶）可能成为KRAS驱动癌症的潜在治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SNARE与KRAS相互作用验证
验证SNORD50A/B调控的KRAS邻近蛋白是否为SNARE家族成员及其相互作用方式
通过PLA、共免疫沉淀、远西印迹、交联质谱和MST检测KRAS与SNAP23、SNAP29、VAMP3的邻近与直接结合
KRAS与SNORD50A/B、SNARE的竞争结合分析
检验SNORD50A/B RNA是否竞争性抑制SNARE与KRAS结合
用MST测定KRAS与SNORD50A/B RNA及SNAP23、SNAP29的结合亲和力，并在RNA竞争条件下检测结合变化，同时使用长度与组成匹配的 scrambled RNA对照
SNARE对KRAS亚细胞定位的影响
确定SNARE是否参与KRAS向质膜的运输
用Cas9与串联向导RNA构建SNARE bulk TKO细胞，通过高分辨共聚焦与超分辨显微镜检测KRAS及HRAS、NRAS与Arf6、Rab11的共定位
SNARE对KRAS下游信号与基因调控的影响
检验SNARE缺失是否影响KRAS与受体、效应分子及下游信号
通过PLA检测KRAS与EGFR、Raf1、PI3K P110α的邻近，Western blot检测pERK、pAKT，RNA-seq分析KRAS依赖转录特征
SNARE在KRAS驱动肿瘤发生中的体内验证
评估SNARE对KRAS驱动体内肿瘤发生的必要性及KRAS选择性
在免疫缺陷小鼠皮下移植KRAS驱动人癌细胞及DLD-1同源细胞系，检测肿瘤生长与信号，并进行CRISPR共必需性筛选
靶向SNAP23的肉毒毒素蛋白酶验证
检验非遗传学方式切割SNAP23能否抑制KRAS驱动肿瘤发生
在H23细胞中表达肉毒毒素E型催化轻链K224D突变体与野生型对照，检测细胞生长与小鼠皮下肿瘤体积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证信号与基因表达
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 邻近蛋白标记质谱 | MyOne C1磁珠 | -- | -- |
| 胶体蓝染色 | ThermoFischer | -- | |
| 交联质谱 | BS3交联剂 | -- | -- |
| 胰蛋白酶/LysC | Promega | -- | |
| 远西印迹 | SNAP23重组蛋白 | Origene | -- |
| SNAP29重组蛋白 | Origene | -- | |
| VAMP3重组蛋白 | LSbiosciences | -- | |
| VAMP3重组蛋白 | MyBiosource | -- | |
| Raf1重组蛋白 | Origene | -- | |
| RALGDS重组蛋白 | Origene | -- | |
| PIK3CG重组蛋白 | Origene | -- | |
| SNAP25重组蛋白 | abcam | -- | |
| KRAS蛋白 | abcam | -- | |
| SuperSignal West Dura化学发光试剂 | ThermoFischer | -- | |
| 考马斯染色试剂盒 | Biorad | -- | |
| 微量热泳动 | NT-647红色NHS染料 | Nanotemper Technologies | -- |
| Monolith NT.115微量热泳动仪 | Nanotemper Technologies | -- | |
| 免疫荧光与PLA | 抗Panras C-4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166691 |
| 抗RAS-GTP抗体 | Neweast Bioscienes | 26909 | |
| 抗KRAS抗体 | Proteintech | 12063-1-AP | |
| 抗HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| 抗NRAS抗体 | Proteintech | 10724-1-AP | |
| 抗SNAP23抗体 | Proteintech | 10825-1-AP | |
| 抗SNAP29抗体 | Proteintech | 12704-1-AP | |
| 抗VAMP3抗体 | Proteintech | 10702-1-AP | |
| 抗Raf1 C12抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-133 | |
| 抗EGFR 1005抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-03-G | |
| 抗p110α抗体 | Cell Signaling Technologies | 4249 | |
| 抗RAB11 KT80抗体 | Abcam | ab95375 | |
| 抗ARF6 3A-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7971 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technologies | 4377 | |
| 抗p44/42 Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technologies | 9107 | |
| 抗磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| 抗AKT(pan)抗体 | Cell Signaling Technologies | 2920 | |
| Duolink原位橙色PLA试剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 488鬼笔环肽 | Invitrogen | -- | |
| 含DAPI的Prolong Gold封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 交联免疫沉淀 | 质膜分离试剂盒 | Abcam | -- |
| Protein G磁珠 | ThermoFischer Scientific | -- | |
| 蛋白酶K | New England Biosciences | -- | |
| miRNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ISCRIPT cDNA合成试剂盒 | Biorad | -- | |
| SYBR Green | ThermoFischer Scientific | -- | |
| RNA测序 | Truseq v2 RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- | |
| CRISPR筛选 | DNA血液与组织提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 慢病毒感染 | Transit X2转染试剂 | Miuras | -- |
| Lenti-X浓缩试剂 | Clontech | -- | |
| 体内肿瘤实验 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| PrimeSTAR Max DNA聚合酶预混液 | Takara | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| BioAnalyzer生物分析仪 | Agilent Genomics | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter Blue细胞活力检测 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KRAS邻近蛋白标记质谱 | 细胞系与SNORD50A/B KO克隆数量、生物素浓度50 μM、标记24 h、SAINT与倍数变化阈值 阅读提示：Methods中Proximity Protein Labeling/Mass Spectrometry小节及Fig. 1图注 |
| SNARE与KRAS相互作用验证 | PLA所用抗体与单抗体对照、共免疫沉淀细胞裂解条件、远西印迹重组蛋白来源与KRAS用量、MST标记与稀释方案 阅读提示：Methods中Immunofluorescence and Proximity Ligation Assay、Far Western Blotting、Microscale thermophoresis小节及Fig. 2、Fig. 3图注 |
| SNARE TKO细胞构建与定位分析 | Cas9与串联向导RNA靶向SNAP23、SNAP29、VAMP3的敲除效率、回收内体标志物Arf6与Rab11、显微镜类型 阅读提示：Methods中CRISPR-Cas9 mediated Gene Knockout、Immunofluorescence and Proximity Ligation Assay、Microscopy小节及Fig. 4图注 |
| 体内移植瘤实验 | SHO小鼠周龄与性别、H23注射5e5细胞、DLD-1注射5e6细胞、每组4只小鼠、肿瘤生长4周、肿瘤体积测量方式 阅读提示：Methods中In vivo Tumorigenesis Studies小节及Fig. 6、Fig. 7图注 |
| CRISPR共必需性筛选 | 1000条guide RNA文库、感染MOI 0.3、14个肿瘤样本、测序深度与PhiX比例、经验FDR计算方法 阅读提示：Methods中CRISPR-Cas9 mediated Gene Knockout小节及Fig. 7图注 |
| 肉毒毒素E轻链实验 | LC/E与LC/EK224D表达构建、嘌呤霉素1 mg/ml筛选、培养生长n=2、肿瘤体积n=10 阅读提示：Methods中Botulism Toxin E小节及Fig. 7图注 |
| TCGA生存分析 | 胰腺癌KRAS突变患者样本量n=186与n=162、SNAP23与VAMP3突变及表达分组定义 阅读提示：Methods中TCGA Patient Survival and Gene Expression Analysis小节及Fig. 6图注 |