hPSC基石黏着斑的形态与动态表征
确认基石FA的形态、稳定性和集落边缘分布特征
在VTN包被表面培养hPSC，利用SIM、Airyscan和活细胞成像观察paxillin阳性基石FA与actin fence，并分析其寿命和最大尺寸
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人类多能干细胞中基石黏着斑的超分辨结构
Superresolution architecture of cornerstone focal adhesions in human pluripotent stem cells.
实验完整度
高含体外hPSC模型、活细胞成像、iPALM超分辨结构分析、siRNA/shRNA功能验证及nano-grid表型验证
主要模型
人诱导多能干细胞系HEL24.3 人诱导多能干细胞系HEL11.4 U2OS骨肉瘤细胞 ARPE-19正常视网膜上皮细胞
重点核对
活细胞成像中paxillin-EGFP每1分钟采集，集落至少记录105 min（来自三次独立实验的16个集落） iPALM对各蛋白按Zcentre高斯拟合定量，actin和α-actinin采用双高斯拟合 nano-grid为800 nm宽脊与600 nm深沟交替，VTN包被浓度5 μg/ml siRNA终浓度1 μM，转染后48 h铺板并培养24 h后固定或裂解 E6分化实验中BMP-4浓度为100 ng/ml，于第1、3、6天取样
摘要
虽然已知关键转录程序对维持多能性很重要，但对细胞黏附于细胞外基质的需求仍不清楚。人类多能干细胞（hPSCs）形成由肌动蛋白环包围的集落，并具有大型稳定的基石黏着斑（FA）。利用超分辨双色干涉光激活定位显微镜，我们检查了基石黏着斑的三维结构，并报告FA蛋白的垂直分层具有三个不同于先前研究的黏着斑的主要结构特征：1）整合素β5和talin以高密度存在于基石FA边缘，邻近垂直的富含kank的蛋白墙；2）vinculin定位高于先前报道，呈现头在尾上的方向；3）令人惊讶的是，actin和α-actinin存在于两个离散的z层。最后，我们报告敲低kank会减弱FA图案化以及集落内的肌动蛋白组织，表明kank在hPSC集落结构中起作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hPSC集落边缘大型稳定的基石黏着斑具有何种三维超微结构，其结构是否与多能性维持及集落架构相关。
- 核心机制
- 基石FA内FA蛋白呈垂直分层，整合素β5和talin在FA边缘高密度分布并邻近富含kank的垂直蛋白墙，vinculin呈头在尾上的倒置取向，actin和α-actinin形成两个离散z层；kank参与维持FA图案化和集落内肌动蛋白组织。
- 主要证据
- 利用iPALM对Eos标记的整合素αV/β5、paxillin、talin-1、vinculin、actin、α-actinin-1、kank1和kank2进行三维定位，结合SIM、Airyscan和活细胞成像；nano-grid限制FA尺寸与取向可加速自发分化；siRNA敲低kank1和kank2改变集落边缘与中央FA大小。
- 研究意义
- 揭示hPSC基石黏着斑不同于经典FA的独特纳米级结构，并提示基石FA架构可能参与支持多能性及hPSC集落架构。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
nano-grid限制FA尺寸与取向
检验限制FA大小和取向对集落形态及多能性的影响
将hPSC铺于VTN包被的nano-grid，比较FA面积、集落形态、E-cadherin连接及E6培养下Oct4、Sox2、SSEA-1变化
iPALM解析基石FA三维结构
确定各FA蛋白在基石FA内的横向和垂直定位
瞬时表达Eos标记的整合素αV、β5、paxillin、talin-1、vinculin、actin、α-actinin-1、kank1和kank2，行iPALM成像并以paxillin为参考进行双色分析
vinculin取向及功能验证
验证vinculin头在尾上的倒置取向并评估其对集落和多能性的作用
比较vinculin-N与vinculin-C的z位置，双色iPALM与内源paxillin共定位；用慢病毒shRNA沉默vinculin并观察集落、actin fence和Oct4
kank1和kank2定位与功能
确定kank在基石FA周围的纳米级定位及其对FA大小的影响
双色iPALM成像Eos-kank1/kank2与内源paxillin，并用siRNA同时敲低kank1和kank2后量化集落边缘和中央FA面积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354277 |
| 玻连蛋白 | Life Technologies | A14700 | |
| Essential 8基础培养基 | Life Technologies | A15169-01 | |
| E8添加剂 | Life Technologies | A1517-01 | |
| DMEM/F12培养基 | Life Technologies | 10565-018 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1860 | |
| Essential 6培养基 | Gibco | A1516401 | |
| 分化处理 | 骨形态发生蛋白4 | R&D systems | 314-BP |
| 转染 | DNA-in转染试剂 | MTI-Global Stem | -- |
| Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 31985070 | |
| siRNA敲低 | Accell siRNA kank1 | Dharmacon | E-012879-00-0005 |
| Accell siRNA kank2 | Dharmacon | E-027345-00-0005 | |
| Accell非靶向对照池 | Dharmacon | D-001910-10-20 | |
| shRNA敲低 | shScramble对照 | Sigma Aldrich | SHC002 |
| shVin#1 | -- | TRCN0000116755 | |
| shVin#2 | -- | TRCN0000116756 | |
| Western blot | 抗paxillin小鼠抗体 | BD biosciences | 612405 |
| 抗β-actin小鼠抗体 | Sigma Aldrich | A1978 | |
| 抗GAPDH小鼠抗体 | Hytest | 5G4MaB6C5 | |
| 抗Sox2小鼠抗体 | R&D systems | MAB2018 | |
| 抗vinculin小鼠抗体 | Sigma Aldrich | V9131 | |
| 抗talin小鼠抗体 | Sigma Aldrich | T3287 | |
| 免疫荧光 | 抗β3整合素抗体 | AbD Serotec | MCA728 |
| 抗αVβ5整合素抗体 | Millipore | MAB2019Z | |
| iPALM | 抗paxillin抗体 | Santa Cruz | sc-365379 |
| 免疫荧光 | 抗E-cadherin抗体 | Abcam | ab1416 |
| 抗α-actinin抗体 | Sigma Aldrich | A5044 | |
| Western blot | 抗Oct3/4兔抗体 | Santa Cruz | sc-9081 |
| 抗kank1兔抗体 | Bethyl | A301-882A | |
| 抗kank2兔抗体 | Sigma aldrich | HPA015643 | |
| 免疫荧光 | 抗整合素β5兔抗体 | Cell Signaling Technology | 3629 |
| Western blot | 抗E-cadherin兔抗体 | Cell Signalling Technology | 3195S |
| 免疫荧光 | 抗paxillin兔抗体 | Santa Cruz | sc-5574 |
| 抗Nanog山羊抗体 | R&D systems | AF1997 | |
| 荧光检测 | Alexa Fluor 488驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 568驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 568驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 647驴抗山羊IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 荧光染色 | SiR-actin | Cytoskeleton | CY-SC001 |
| Atto 405鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 488鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot检测 | Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| ECL Plus蛋白质印迹试剂 | GE Healthcare | -- | |
| 图像采集 | LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| Marianas转盘成像系统 | -- | -- | |
| DeltaVision OMX v4结构光照明显微镜 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 活细胞成像 | Photometrics Evolve EMCCD相机 | -- | -- |
| iPALM | 金纳米棒基准标记 | Nanopartz, Inc. | -- |
| 流式分选 | FACSAria IIu流式细胞仪 | BD | -- |
| 质粒构建 | Phusion热启动II聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hPSC培养与基石FA观察 | 细胞系HEL24.3/HEL11.4来源、VTN包被浓度5 μg/ml、E8培养基、传代用0.5 mM EDTA 3 min 阅读提示：Methods中Cell culture gene silencing and transient transfection小节 |
| 活细胞成像与FA动态量化 | paxillin-EGFP标记方式、每1分钟采集、至少105 min、边缘5 μm条带与中央区域定义、三级独立实验16个集落 阅读提示：Methods中Paxillin dynamics experiments小节及Fig. 1c–f图注 |
| nano-grid限制实验 | 脊宽800 nm、沟深600 nm、VTN 5 μg/ml、E8/E6培养时间点、BMP-4 100 ng/ml阳性对照 阅读提示：Methods中Nano-grid experiments小节及Fig. 2图注 |
| iPALM超分辨成像 | Eos标记质粒来源、561 nm与405 nm激光强度、50 ms曝光、40,000–80,000张图像、Zcentre高斯或双高斯拟合 阅读提示：Methods中iPALM小节及Supplementary Table 1 |
| kank与vinculin功能敲低 | siRNA终浓度1 μM及两次转染时间、shRNA序列与puromycin 2 μg/ml筛选、边缘与中央FA面积量化定义 阅读提示：Methods中基因沉默小节及Fig. 6e, f、Supplementary Fig. 9b–d图注 |