SNL模型建立与circRNA表达谱筛选
鉴定神经损伤后脊髓背角差异表达的circRNA。
大鼠进行L5脊神经结扎，取背角组织进行rRNA去除和RNase R处理后的RNA-seq，并用qPCR验证候选circRNA。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
脊髓中的CircAnks1a调控神经病理性疼痛啮齿动物模型中的痛觉过敏
CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain.
实验完整度
高包含RNA-seq、SNL大鼠模型、siRNA/AAV增益丢失功能、电生理、行为学及分子机制验证
主要模型
SNL大鼠脊髓背角组织 原代培养脊髓背角神经元/脊髓切片 VEGFBflox/flox小鼠 293T细胞与C6细胞
重点核对
SNL术后7天和14天circAnks1a在背角神经元细胞质和细胞核中表达均升高 鞘内注射circAnks1a siRNA（1 nmol 10 µl−1，连续5天）可减轻SNL诱导的痛行为 背角过表达circAnks1a（AAV，600 nl，注射后21天）降低正常大鼠缩足阈值和潜伏期 circAnks1a促进YBX1与transportin-1相互作用及YBX1核转位 核内circAnks1a结合Vegfb启动子−1834至−1687区域并促进YBX1募集
摘要
环状RNA是非编码RNA，在中枢神经系统中富集。啮齿动物神经损伤后，脊髓背角神经元参与痛觉过敏。本研究表明，脊神经结扎与背角神经元中circAnks1a在细胞质和细胞核中的表达增加相关。通过siRNA下调circAnks1a可减轻神经损伤诱导的痛样行为。在细胞质中，circAnks1a促进转录因子YBX1与transportin-1的相互作用，从而促进YBX1的核转位。在细胞核中，circAnks1a直接结合Vegfb启动子，增加YBX1向Vegfb启动子的募集，从而促进转录。此外，细胞质circAnks1a作为miRNA海绵，参与miR-324-3p介导的VEGFB表达转录后调控。VEGFB上调导致背角神经元兴奋性增加及神经损伤诱导的痛行为。我们提出circAnks1a和VEGFB是神经病理性疼痛的调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脊髓背角神经元中circAnks1a是否参与神经病理性疼痛，以及其通过何种分子机制调控痛觉过敏。
- 核心机制
- 神经损伤后circAnks1a上调：细胞质中circAnks1a促进YBX1与transportin-1相互作用，促进YBX1核转位；核内circAnks1a直接结合Vegfb启动子并增加YBX1募集，促进Vegfb转录；同时细胞质circAnks1a作为miR-324-3p海绵解除其对VEGFB翻译的抑制，最终VEGFB上调增强背角神经元兴奋性。
- 主要证据
- SNL大鼠背角RNA-seq和qPCR显示circAnks1a升高；circAnks1a siRNA减轻痛行为和神经元兴奋性，AAV过表达诱导痛敏；RNA pulldown、RIP、EMSA、ChIP、ChIRP和双荧光素酶实验证实circAnks1a-YBX1-transportin-1-Vegfb通路及miR-324-3p海绵作用；VEGFB siRNA和VEGFBflox/flox小鼠实验证实VEGFB参与痛行为。
- 研究意义
- 首次揭示脊髓特异性circAnks1a通过转录和转录后水平调控VEGFB表达，参与神经损伤诱导的中枢敏化和痛行为，为神经病理性疼痛治疗提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circAnks1a特性鉴定
验证circAnks1a的环状结构、稳定性、组织分布和亚细胞定位。
Sanger测序、随机六聚体与oligo(dT)18引物逆转录、RNase R消化、northern blot、actinomycin D处理、FISH和核质分离qPCR。
circAnks1a功能验证
确定circAnks1a对痛行为和神经元兴奋性的影响。
鞘内注射circAnks1a siRNA或mAnks1a siRNA，脊髓背角注射AAV-circAnks1a-EGFP，进行电生理记录和痛行为测试。
VEGFB功能验证
验证VEGFB在神经病理性疼痛中的作用。
鞘内注射VEGFB siRNA，脊髓背角注射AAV-Cre-mCherry至VEGFBflox/flox小鼠，或注射AAV-VEGFB-EGFP，检测电生理和痛行为。
circAnks1a调控VEGFB的机制验证
阐明circAnks1a通过YBX1和miR-324-3p调控VEGFB的分子通路。
RNA pulldown、质谱、RIP、EMSA、ChIP、ChIRP、双荧光素酶报告基因和FISH实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA测序 | Epicenter Ribo-Zero rRNA去除试剂盒 | Illumina | -- |
| RNase R | Epicenter | -- | |
| NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- | |
| Agilent 2200 TapeStation | Agilent | -- | |
| Illumina HiSeq 3000测序平台 | Illumina | -- | |
| RNA提取 | 细胞质与细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek Corp. | -- |
| Trizol试剂 | Life Technologies | -- | |
| miRNA qRT-PCR | All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒 | GeneCopoeia | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript RT Master Mix | Takara | -- |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| 行为学测试 | Von Frey纤维 | -- | -- |
| Ugo Basile足底测试仪 | Ugo Basile | -- | |
| 鞘内注射 | 聚乙烯-10导管 | -- | -- |
| 脊髓切片 | 琼脂糖 | Sigma | -- |
| Leica VT-1000 S振动切片机 | Leica | -- | |
| 膜片钳记录 | P-2000G微电极拉制仪 | Sutter Instruments | -- |
| EPC 10放大器 | HEKA Elektronik | -- | |
| 印防己毒素 | -- | -- | |
| 生物胞素 | Sigma | -- | |
| 质谱分析 | AB Sciex TripleTOF 6600系统 | AB Sciex | -- |
| RNA pull-down | 链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | -- |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| Ago2抗体 | Abcam | ab32381 | |
| RIP/ChIP/Western blot | YBX1抗体 | Abcam | ab12148 |
| ChIP | ChIP实验试剂盒 | Thermo | -- |
| 免疫荧光 | VEGFB抗体 | Santa Cruz | sc-80442 |
| YBX1抗体 | Biorbyt | orb8480 | |
| GFAP抗体 | CST | 3670 | |
| Iba1抗体 | Abcam | ab5076 | |
| NeuN抗体 | Millipore | MAB377 | |
| Co-IP | 免疫共沉淀试剂盒 | Pierce | -- |
| transportin-1抗体 | GeneTex | GTX103003 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pMIR-Report荧光素酶载体 | Ambion | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| pGL3-Basic载体 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| Western blot | 组蛋白H3抗体 | Biorbyt | orb136531 |
| β-actin抗体 | CST | 4967 | |
| Northern blot | DIG Northern起始试剂盒 | Roche | -- |
| Hybond-N+膜 | GE Healthcare | -- | |
| EMSA | LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒 | Pierce | -- |
| 重组YBX1蛋白 | Abcam | ab187443 | |
| Transportin-1蛋白 | GeneTex | GTX103003 | |
| 病毒包装 | T7 RNA聚合酶 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SNL模型建立 | 动物品系（雄性Sprague–Dawley大鼠，200–220 g）、结扎神经（L5）、结扎线（6–0丝线）、假手术组处理方式 阅读提示：Methods中Animals和SNL and behavioral tests小节 |
| circAnks1a敲低 | siRNA剂量（1 nmol 10 µl−1）、给药途径（鞘内注射）、给药时间（SNL前30分钟开始，连续5天）、对照scramble siRNA 阅读提示：Methods中Intrathecal or intraspinal injection小节及Fig. 3图注 |
| circAnks1a过表达 | AAV血清型（AAV2/9）、注射体积（600 nl）、注射位点（L4–L6背角，4个位点各150 nl）、检测时间（注射后21天） 阅读提示：Methods中Intrathecal or intraspinal injection小节及Supplementary Fig. 3 |
| 电生理记录 | 脊髓切片厚度（400 μm）、记录神经元类型（NK1R阳性lamina I/II）、mEPSC记录条件（TTX 0.5 µM，picrotoxin 100 µM，钳制电压−70 mV）、每组n值 阅读提示：Methods中Spinal cord slice preparation、mEPSC recordings小节及Fig. 3图注 |
| VEGFB功能验证 | VEGFB siRNA剂量（1 nmol 10 µl−1，连续5天）、VEGFBflox/flox小鼠AAV-Cre-mCherry注射方案（体积、位点）、检测时间点 阅读提示：Methods中Intrathecal or intraspinal injection小节及Fig. 4图注 |
| miR-324-3p调控 | miR-324-3p agomir/antagomir剂量（1 nmol day−1，连续5天）、给药途径（鞘内注射）、检测时间点（SNL后14天） 阅读提示：Methods中Intrathecal or intraspinal injection小节及Fig. 10图注 |