商业CRISPR编辑细胞系面板分析
检测 presumed 基因敲除细胞系中是否产生意外的mRNA或蛋白质
对来自Horizon Discovery的HAP1 CRISPR编辑克隆进行Western blot（使用两种抗体）和RT-PCR分析，并通过cDNA测序鉴定新剪接变体。
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基于CRISPR-Cas9的诱变常引起靶向mRNA的错误调控
CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation.
实验完整度
高使用多种细胞系进行 Western blot、RT-PCR、测序及功能实验，包含机制验证和功能验证。
主要模型
HAP1细胞系（商业获取的CRISPR编辑克隆） MIA PaCa-2细胞系（CRISPR编辑克隆） RMS13细胞系（CRISPR编辑克隆） HELA细胞系（用于cDNA表达）
重点核对
细胞系来源与编辑：HAP1购自Horizon Discovery，MIA PaCa-2、RMS13、HELA购自ATCC CRISPR编辑克隆的INDEL鉴定：基因组DNA测序确认靶向突变 mRNA剪接变化检测：RT-PCR及cDNA测序 蛋白质表达检测：Western blot使用两种针对不同表位的抗体 NMD抑制实验：环己酰亚胺（CHX）处理浓度与时间未明确说明
摘要
通过非同源末端连接（NHEJ）途径引入插入缺失（INDEL）是CRISPR-Cas9定向基因组编辑的机制基础。利用CRISPR-Cas9进行选择性基因消融是通过移码诱导性INDEL引入提前终止密码子（PTC），从而引发突变mRNA的无义介导降解（NMD）来实现的。在此，通过检查 presumed 基因敲除的细胞系面板中CRISPR靶向基因的mRNA和蛋白质产物，我们在约50%的细胞系中检测到外源mRNA或蛋白质的产生。我们证明这些异常蛋白质产物源于引入了促进内部核糖体进入、将假mRNA（带有PTC的选择性剪接mRNA）转化为蛋白质编码分子、或通过破坏外显子剪接增强子（ESE）诱导外显子跳跃的INDEL。我们的结果揭示了基于INDEL的诱变在操纵基因表达结果方面面临的挑战，以及有助于减轻其对预期基因组编辑结果影响的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CRISPR-Cas9引入的移码INDEL在靶基因中是否总能导致预期的基因敲除，还是会产生意外的mRNA和蛋白质产物？
- 核心机制
- INDEL可促进内部核糖体进入、将假mRNA转化为蛋白质编码mRNA、或破坏ESE导致外显子跳跃，从而产生异常蛋白质；ATI可抑制NMD。
- 主要证据
- 在约50%的CRISPR编辑细胞系中检测到新mRNA或蛋白质；TOP1、LKB1、SUFU、LRP5等基因的编辑克隆中通过Western blot、RT-PCR和测序验证了外显子跳跃、ATI和假mRNA翻译。
- 研究意义
- 揭示了基于INDEL的诱变在操纵基因表达结果方面的挑战，并提出了CRISPinatoR工具等减轻影响的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TOP1突变克隆的功能验证
验证截短的TOP1蛋白是否保留催化活性及亚细胞定位
对TOP1 ΔE6克隆进行核质分离和Western blot，并使用酶学实验检测超螺旋DNA松弛活性。
LKB1基因编辑克隆的机制分析
探究LKB1 INDEL如何导致ATI和假mRNA翻译
对HAP1和MIA PaCa-2 LKB1编辑克隆进行Western blot、RT-PCR、cDNA克隆和测序，并在HELA细胞中表达携带INDEL的LKB1 cDNA。
SUFU外显子跳跃的ESE机制验证
验证INDEL破坏ESE导致外显子跳跃
在HAP1和RMS13细胞中利用sgRNA靶向SUFU外显子，通过Western blot和RT-PCR分析外显子跳跃。
LRP5外显子对称性对基因敲除效果的影响
测试CRISPinatoR设计的sgRNA靶向对称/不对称外显子的效果
在HAP1细胞中编辑LRP5外显子2（不对称）和外显子16（对称），通过Western blot、RT-PCR和WNT报告基因实验分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Fisher Scientific | ICN10055225 |
| 核质分离 | NE-PER核质提取试剂 | ThermoFisher | 78833 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | S8820 |
| BioRad Criterion TGX预制胶 | BioRad | -- | |
| AXIN1抗体 | Cell Signaling Technology | 2087 | |
| AXIN1抗体 | Cell Signaling Technology | 2074 | |
| BAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 13271 | |
| BCL2L2抗体 | Cell Signaling Technology | 2724 | |
| LRP6抗体 | Cell Signaling Technology | 2560 | |
| PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9552 | |
| RICTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 9476 | |
| SIRT1抗体 | Cell Signaling Technology | 2493 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| TLE3抗体 | Cell Signaling Technology | 4681 | |
| LKB1抗体 | Cell Signaling Technology | 3050 | |
| SUFU抗体 | Cell Signaling Technology | 2520 | |
| LRP5抗体 | Cell Signaling Technology | 5731 | |
| BAP1抗体 | Bethyl Laboratories | A302-243A-T | |
| RICTOR抗体 | Bethyl Laboratories | A300-459A | |
| SIRT1抗体 | Bethyl Laboratories | A300-688A | |
| TOP1抗体 | Bethyl Laboratories | A302-589A | |
| TOP1抗体 | Bethyl Laboratories | 302-590A | |
| VPS35抗体 | Bethyl Laboratories | A304-727A | |
| TBK1抗体 | Abcam | 40676 | |
| PPM1A抗体 | Abcam | 14824 | |
| SUFU抗体 | Abcam | 52913 | |
| LRP6抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-25317 | |
| TLE3抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-9124 | |
| LKB1抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-374334 | |
| LRP5抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-390267 | |
| BCL2L2抗体 | LS BioScience | LS-C382259-100 | |
| PPM1A抗体 | LS BioScience | LS-C169090-100 | |
| CTNNB1抗体 | Sigma-Aldrich | C2206 | |
| PTEN抗体 | Invitrogen | 44-1064 | |
| CTNNB1抗体 | BD Biosciences | 610153 | |
| VPS35抗体 | Genetex | GTC108058 | |
| 转染 | Effectene转染试剂 | Qiagen | -- |
| 基因组DNA提取 | 基因组DNA迷你试剂盒 | Bioland Scientific | -- |
| PCR | GoTaq Green预混液 | Promega | M7122 |
| PCR产物纯化 | QIA Quick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| 克隆 | TOPO TA克隆试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | ProtoScript第一链cDNA合成试剂盒 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 商业CRISPR编辑细胞系分析 | 细胞系来源（HAP1，Horizon Discovery）、克隆编号、INDEL类型（补充表1） 阅读提示：Methods 'Cell lines and reagents'；Supplementary Table 1 |
| Western blot检测 | 抗体品牌、货号、稀释度（如1:1000）、细胞裂解液配方（PBS/1% NP40+蛋白酶抑制剂） 阅读提示：Methods 'Western blot analysis'；Supplementary Table 2 |
| RT-PCR及cDNA测序 | 引物序列（补充表3）、PCR条件、测序方法 阅读提示：Methods 'RNA extraction and analysis'；Supplementary Table 3 |
| CHX处理实验 | CHX浓度、处理时间（文中未明确说明） 阅读提示：Results 'ATI suppresses NMD'；Supplementary Fig. 7 |
| LRP5 WNT报告基因实验 | WNT3A条件培养基制备、抑制剂浓度（WNT974、IWR1）、报告基因检测方法、重复数（三次独立实验，每次三重复） 阅读提示：Figure 5 legend；Results 'Targeting RNA-regulatory elements for gene knockout agendas' |