跨物种促纤维化基因网络鉴定
识别与心脏纤维化相关且跨物种保守的转录程序。
对大鼠RI株左心室RNA-seq进行共表达网络分析并与间质和血管周围纤维化关联；对人类DCM左心室和rTOF右心室RNA-seq进行共表达网络分析，比较跨物种保守性和疾病差异共表达。
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WWP2通过调控SMAD2信号调控病理性心脏纤维化
WWP2 regulates pathological cardiac fibrosis by modulating SMAD2 signaling.
实验完整度
高含大鼠RI株与人类DCM/rTOF队列组学、Wwp2突变小鼠AngII及MI模型、原代心脏成纤维细胞功能与机制验证。
主要模型
30株大鼠重组近交系左心室RNA-seq 人类扩张型心肌病患者左心室及修复法洛四联症患者右心室样本 WWP2Mut/Mut小鼠及野生型小鼠 原代小鼠及人心脏(肌)成纤维细胞
重点核对
WWP2Mut/Mut小鼠在AngII灌注(500 ng/kg/min,4周)或MI模型后纤维化面积与心功能(EF%、FS%) 原代心脏(肌)成纤维细胞TGFβ1处理浓度5 ng/ml、时间16–72 h siRNA靶向Wwp2 mRNA 5′或3′端(20 nM)及WWP2-FL/WWP2-N质粒回补实验 SMAD2单泛素化检测中MG132 10 μM 3 h后TGFβ1 5 ng/ml 6 h 动物实验每组n≥8，体外实验至少独立重复三次
摘要
心脏纤维化是遗传性和获得性心脏病的最终共同病理改变，可导致心脏电活动和泵功能衰竭。本文中，我们运用系统遗传学方法识别出病态心脏中的促纤维化基因网络，并证明该网络受E3泛素连接酶WWP2调控，具体由WWP2-N端异构体调控。重要的是，这一受WWP2调控的促纤维化基因网络在以纤维化为特征的不同心脏疾病中保守存在：人类和小鼠扩张型心肌病以及修复后的法洛四联症。缺乏WWP2蛋白N端区域的转基因小鼠在压力负荷或心肌梗死后表现出心脏功能改善和心肌纤维化减少。在原代心脏成纤维细胞中，WWP2正向调控促纤维化标志物和细胞外基质基因的表达。TGFβ1刺激促进含N端区域的WWP2异构体核转位及其与SMAD2的相互作用。WWP2介导TGFβ1诱导的SMAD2核质穿梭和转录活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 病态心脏中是否存在跨物种保守的促纤维化基因网络，以及哪个主调控基因调控该网络并影响病理性心脏纤维化。
- 核心机制
- WWP2含N端的异构体(WWP2-FL/N)受TGFβ1刺激转位入核并与SMAD2相互作用，促进SMAD2单泛素化，调控其核质穿梭和转录活性，从而正向调控促纤维化细胞外基质基因网络。
- 主要证据
- 大鼠RI株与人类DCM/rTOF心脏的共表达网络及网络eQTL定位到WWP2位点；WWP2Mut/Mut小鼠在AngII和MI模型中纤维化减少、心功能改善；原代心脏(肌)成纤维细胞中WWP2缺失降低TGFβ1诱导的促纤维化标志物，siRNA和回补实验验证；SMAD2单泛素化、核质分布及荧光素酶报告实验支持机制。
- 研究意义
- 研究提示WWP2是调控病理性心脏纤维化的潜在可成药靶点，为控制心脏重构向心力衰竭进展提供新的方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
网络eQTL定位主调控基因
定位调控ECM基因网络的遗传位点并确定主调控基因。
用贝叶斯网络eQTL方法将大鼠ECM网络映射到大鼠基因组，再在人类DCM中映射到同源位点，鉴定WWP2位点及调控SNP rs9936589，并进行WWP2异构体cis-eQTL分析。
Wwp2突变小鼠体内纤维化验证
检验含N端区域的WWP2异构体缺失对体内纤维化和心功能的影响。
构建携带Wwp2外显子2 4-bp缺失的WWP2Mut/Mut小鼠，分别进行AngII灌注和MI模型，检测纤维化组织学、心功能超声、胶原含量及促纤维化蛋白表达，并进行心脏RNA-seq。
原代心脏成纤维细胞功能验证
验证WWP2对TGFβ1诱导的促纤维化反应的细胞自主作用。
分离小鼠及人原代心脏(肌)成纤维细胞，TGFβ1处理，采用siRNA敲低Wwp2 5′或3′端及WWP2-FL/N质粒回补，检测ACTA2、COL1A1、POSTN等促纤维化标志物。
SMAD2机制验证
阐明WWP2调控TGFβ1/SMAD2信号的分子机制。
检测WWP2与SMAD2相互作用、SMAD2单泛素化、SMAD2荧光素酶报告活性、核质分离及SB431542处理后的SMAD2核输出。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Alzet微型渗透泵 | Durect Corporation | 1004 |
| 血管紧张素II | Sigma Aldrich | A9525 | |
| 细胞培养 | 人TGFβ1 | Sigma Aldrich | T7039 |
| MG132 | Sigma Aldrich | M7449 | |
| SB431542 | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | Life technologies holdings | 13778075 |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies Holdings | 11668019 |
| 组织学染色 | 天狼星红胶原染色试剂盒 | Chondrex, Inc. | 9046 |
| Masson三色染色试剂盒 | Sigma Aldrich | HT15 | |
| Western blot | 抗WWP2 N端区域抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc30052 |
| 抗WWP2 C端区域抗体 | Aviva Systems Biology | ARP43089_P050 | |
| 抗ACTA2抗体 | Sigma Aldrich | A5228 | |
| 抗S100A4抗体 | Abcam | ab41532 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab45939 | |
| 抗骨膜蛋白抗体 | Novus Bio | NBP1-30042 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Sigma | SAB4500974 | |
| 抗磷酸化SMAD2抗体 | CST | 18338 | |
| 抗SMAD2/3抗体 | CST | 3102 | |
| 抗SMAD4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | |
| 抗泛素抗体 | CST | 3933 | |
| 免疫荧光 | 牛抗兔IgG-CFL 488二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-362260 |
| 牛抗小鼠IgG-CFL 488二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-362256 | |
| 荧光素酶报告实验 | SMAD荧光素酶报告质粒 | Yeasen | 11543ES03 |
| pGMLR-TK内参质粒 | Yeasen | 11557ES03 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Yeasen | 11402ES60 | |
| RNA提取与反转录 | RNeasy迷你RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | BIORAD | 170-8897 |
| Fast SYBR-Green预混液 | BIORAD | 170-8880AP | |
| 核质分离 | NE-PER核质分离试剂盒 | Pierce | 78833 |
| 免疫共沉淀 | Pierce直接磁珠免疫沉淀/共沉淀试剂盒 | Pierce | 88828 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型(AngII灌注) | AngII剂量500 ng/kg/min、灌注4周、8周龄小鼠、每组n≥8、假手术/生理盐水对照 阅读提示：Methods的Animal studies小节及Fig. 3f–m图注 |
| 动物模型(MI) | 8–10周龄小鼠、左冠状动脉结扎、术后观察4周、每组n≥8 阅读提示：Methods的Animal studies小节及Fig. 3n–p图注 |
| 原代心脏(肌)成纤维细胞TGFβ1处理 | TGFβ1浓度5 ng/ml、处理时间16–72 h、每组n、独立重复次数 阅读提示：Methods的Cell culture experiments小节及Fig. 4c–g、Fig. 5a–g图注 |
| siRNA及回补实验 | siRNA浓度20 nM、靶向5′或3′端、转染时长、WWP2-FL/WWP2-N质粒回补条件 阅读提示：Methods的Cell culture experiments小节及Fig. 4h–n图注 |
| SMAD2泛素化与核质穿梭检测 | MG132 10 μM 3 h后TGFβ1 5 ng/ml 6 h、SB431542处理5 h、核质分离时间点 阅读提示：Methods的Cell culture experiments小节及Fig. 5d, g图注 |