构建神经元特异性GFP-PR28转基因小鼠
实现poly-PR在神经元中的特异性表达以研究其体内作用。
将GFP-PR28构建体插入Rosa26位点获得GFP-PR28flox/flox小鼠，与Thy1-Cre小鼠杂交，经Cre重组酶去除终止密码子，获得杂合和纯合表达鼠。
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表达poly-PR的C9orf72小鼠品系中的运动功能障碍与神经退行性变
Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.
实验完整度
高含转基因小鼠体内模型、行为学、组织学、RNA-seq及qRT-PCR、Western blot多层级验证
主要模型
GFP-PR28flox/flox;Thy1-Cre+纯合转基因小鼠 GFP-PR28flox/+;Thy1-Cre+/−杂合转基因小鼠 C57BL/6遗传背景小鼠
重点核对
小鼠基因型：GFP-PR28flox/+;Thy1-Cre+/−为杂合表达鼠，GFP-PR28flox/+;Thy1-Cre−/−为对照 行为学检测年龄：2、3、6、10、12–16月龄，多数实验使用雄性小鼠 RNA-seq样本：5月龄小脑，6月龄皮层和腰段脊髓，2月龄小脑，每组3只 Western blot检测CaMK IV：6月龄小脑，每组5只 生存分析：纯合鼠n=12、11，杂合鼠n=32、24
摘要
染色体9开放阅读框72（C9ORF72）基因内含子1中的GGGGCC六核苷酸重复扩增是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆最常见的遗传病因。重复相关非ATG翻译产生的二肽重复蛋白（DPRs）参与c9FTD/ALS的神经病理特征。在五种DPRs中，富含精氨酸的poly-PR被认为毒性最强。本研究构建了在神经元中特异性表达poly-PR（GFP-PR28）的转基因小鼠品系。GFP-PR28纯合小鼠生存时间缩短，而杂合小鼠表现出运动失衡、脑重量降低、浦肯野细胞和下运动神经元丢失，以及小脑和脊髓的炎症。转录分析显示，在小脑中，GFP-PR28杂合小鼠突触传递相关基因存在差异表达。我们的发现表明，GFP-PR28转基因小鼠部分模拟了c9FTD/ALS的神经病理特征，并显示poly-PR在神经退行性变中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- poly-PR是否足以在小鼠体内诱导神经退行性变和行为学改变。
- 核心机制
- 神经元表达的poly-PR形成核内聚集体，伴随突触传递相关基因下调及小脑和脊髓胶质细胞活化，导致浦肯野细胞、下运动神经元丢失和运动功能障碍。
- 主要证据
- GFP-PR28杂合小鼠出现运动失衡、步态异常和转棒跌落；小脑和脑重量降低，浦肯野细胞及ChAT阳性下运动神经元减少；GFAP和Iba1升高；小脑RNA-seq显示突触传递相关基因下调并经qRT-PCR和Western blot验证。
- 研究意义
- GFP-PR28转基因小鼠部分模拟c9FTD/ALS的神经病理特征，可作为进一步研究poly-PR作用及其与其他DPR种类异同的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测GFP-PR28表达分布
明确poly-PR在脑区和细胞类型中的聚集分布。
在2月龄和12月龄杂合小鼠脑组织中进行免疫组化，检测GFP、Neu-N、GFAP、Iba1、calbindin、nucleolin等，并用qRT-PCR检测GFP mRNA在各组织中的表达。
评估纯合小鼠表型与生存
确定高表达poly-PR对小鼠体重和生存的影响。
测量20日龄纯合小鼠体型和体重，记录生存曲线。
评估杂合小鼠运动功能与行为
确定poly-PR表达是否引起运动障碍及焦虑样行为。
进行尾部悬吊、握力、笼边缘行为、转棒、平衡木、足迹和旷场实验。
检测神经退行性变与胶质细胞活化
验证poly-PR是否导致脑萎缩、特定神经元丢失和炎症。
测量脑和小脑重量，免疫组化检测calbindin阳性浦肯野细胞、ChAT阳性下运动神经元、Neu-N、GFAP、Iba1和TDP-43。
RNA-seq及差异基因验证
探索poly-PR导致神经元缺陷的分子机制。
对5月龄小脑、2月龄小脑、6月龄皮层和腰段脊髓进行RNA-seq，GO和Reactome富集分析，并用qRT-PCR和Western blot验证候选基因和蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分析转录组与通路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转基因小鼠构建 | 含Cas9/sgRNA的GFP-PR28载体 | Beijing Biocytogen Co., Ltd. | -- |
| 质粒构建 | pEGFP-C1载体 | Clontech Laboratories | -- |
| Western blot | PRO200匀浆器 | PRO Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 小鼠单克隆抗CaMK IV抗体 | Santa Cruz | sc-55501 | |
| 小鼠单克隆抗GAPDH抗体 | Millipore | MAB374 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| 增强化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| ChemiQ4800成像系统 | Bioshine | -- | |
| 免疫组化 | 小鼠单克隆抗Neu-N抗体 | Millipore | MAB377 |
| 山羊多克隆抗胆碱乙酰转移酶抗体 | Millipore | AB144P | |
| 兔多克隆抗Iba1抗体 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| 小鼠单克隆抗GFAP抗体 | Millipore | MAB360 | |
| 兔多克隆抗钙结合蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13176 | |
| 兔多克隆抗PR抗体 | proteintech | 23979-1-AP | |
| 兔多克隆抗Cre重组酶抗体 | Cell Signaling Technology | 15036 | |
| 兔多克隆抗TDP-43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 兔多克隆抗核仁素抗体 | Abcam | ab129200 | |
| 小鼠单克隆抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | ThermoFisher Scientific | A21202 | |
| Alexa Fluor 594标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-585-003 | |
| Hoechst 33342染料 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| 苏丹黑B | -- | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina HiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| qRT-PCR | TransScript第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | -- |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| ABI 7500实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 行为学 | 握力测量仪 | Bioseb | -- |
| 转棒仪 | Ugo Basile | -- | |
| 平衡木装置 | SANS Biological Technology | -- | |
| 旷场箱 | Xinruan Informatlon Technology Co | -- | |
| Anymaze软件 | Stoelting Co | -- | |
| 成像 | IX71显微镜 | Olympus | -- |
| LSM 710激光共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转基因小鼠构建与分组 | GFP-PR28插入Rosa26位点、Thy1启动子驱动、杂合与纯合同窝对照基因型 阅读提示：Methods Animals及Fig. 1a, b |
| 行为学检测 | 检测月龄、性别、每组样本量、训练与重复次数 阅读提示：Methods Behavioral assays及各行为学小节、Fig. 3、Fig. 4图注 |
| 神经病理定量 | 切片厚度与脑区定位、每组动物数、每只切片数 阅读提示：Methods Quantification及Fig. 5、Fig. 6图注 |
| RNA-seq与差异基因分析 | 取材月龄与脑区、每组样本量、DEG筛选阈值 阅读提示：Methods RNA sequencing and bioinformatics analyses及Fig. 7图注 |
| qRT-PCR与Western blot验证 | 内参基因、每组样本量、抗体稀释比例 阅读提示：Methods Quantitative real-time PCR及Western blotting analysis |