多组学数据整合及RPL10 R98S对转录和翻译的影响分析
系统解析RPL10 R98S引起的蛋白质变化在转录和翻译水平的贡献。
对表达RPL10 WT或R98S的Ba/F3细胞进行mRNA测序、核糖体足迹分析、多聚体RNA测序和定量质谱，整合分析差异表达基因、翻译效率及蛋白质变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
翻译组分析揭示T细胞急性淋巴细胞白血病细胞中丝氨酸和甘氨酸代谢的改变
Translatome analysis reveals altered serine and glycine metabolism in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells.
实验完整度
高多组学整合分析结合体外细胞模型、动物模型和患者样本，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Ba/F3小鼠淋巴样细胞系（表达RPL10 WT或R98S） Jurkat T-ALL细胞系（CRISPR-Cas9引入RPL10 R98S） T-ALL细胞系（KE37、DND41、RPMI8402） T-ALL患者样本异种移植小鼠模型（包括PDX X12）
重点核对
RPL10 R98S与WT的Ba/F3细胞克隆数：各3个生物学独立克隆 PSPH敲低所用shRNA序列及敲低效率（40-50%降低） 13C6-葡萄糖示踪浓度11.1 mM，标记时间48小时 体内实验每只小鼠尾静脉注射1×10^6个细胞 PSPH过表达及敲低验证的检测方法（immunoblot、qRT-PCR等）
摘要
近期有报道称癌症中存在体细胞核糖体蛋白突变，但其对细胞转录和翻译的影响仍知之甚少。在此，我们整合了来自小鼠淋巴样细胞模型的mRNA测序、核糖体足迹分析、多聚体RNA测序和质谱数据集，以表征与T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）相关的核糖体RPL10 R98S突变。令人惊讶的是，RPL10 R98S主要通过转录而非翻译效率的改变来诱导蛋白质水平的变化。磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH）编码一个关键的丝氨酸生物合成酶，是唯一一个转录和翻译均升高导致蛋白质过表达的基因。PSPH上调是T-ALL患者样本中的普遍现象，与异种移植小鼠中丝氨酸和甘氨酸水平升高相关。降低PSPH表达可抑制T-ALL细胞系的增殖及其在小鼠中的扩增能力。我们确定了核糖体突变驱动丝氨酸生物合成的诱导，并提供了支持T-ALL细胞依赖于PSPH的证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究T-ALL相关的核糖体RPL10 R98S突变对细胞转录组和翻译组的影响，并阐明其在T-ALL细胞代谢中的作用。
- 核心机制
- RPL10 R98S突变通过转录和翻译水平上调PSPH表达，增强丝氨酸/甘氨酸生物合成，促进甲酸盐和嘌呤合成，从而支持T-ALL细胞增殖；同时分泌的丝氨酸/甘氨酸可促进微环境支持细胞存活。
- 主要证据
- 多组学分析（mRNA-seq、核糖体足迹、多聚体RNA-seq、质谱）显示PSPH转录和翻译上调；代谢示踪证实丝氨酸/甘氨酸合成增加；PSPH敲低抑制T-ALL细胞系增殖及体内扩增；患者样本中PSPH普遍高表达。
- 研究意义
- 揭示了核糖体蛋白突变驱动代谢重编程的机制，支持PSPH作为T-ALL治疗靶点的潜力，并提示T-ALL细胞依赖内源性丝氨酸合成。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PSPH表达上调的验证
验证RPL10 R98S细胞中PSPH在转录、翻译和蛋白质水平的上调。
通过qRT-PCR、多聚体qRT-PCR、免疫印迹在Ba/F3、Jurkat及小鼠lin-骨髓细胞中检测PSPH表达。
丝氨酸/甘氨酸代谢示踪分析
评估RPL10 R98S对丝氨酸和甘氨酸合成的影响。
用13C6-葡萄糖示踪分析Ba/F3细胞中丝氨酸和甘氨酸的合成，并测量细胞内及条件培养基中的代谢物水平。
PSPH在T-ALL细胞增殖和体内扩增中的功能验证
验证PSPH对T-ALL细胞增殖和体内白血病扩增的必要性。
在KE37、DND41、RPMI8402细胞中用shRNA敲低PSPH，检测增殖、凋亡、细胞周期和甲酸盐水平；并将敲低细胞注射到NSG小鼠中评估体内扩增。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Maxwell 16 LEV simplyRNA细胞试剂盒 | Promega | -- |
| 文库构建 | TruSeq链特异性mRNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 核糖体足迹分析 | RNase I | Thermo Scientific | -- |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | -- | |
| T4 RNA连接酶1 | New England Biolabs | -- | |
| MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Clonacell-TCS培养基 | Stemcell technologies | -- |
| Methocult GF M3534培养基 | Stemcell Technologies | -- | |
| EasySep小鼠造血祖细胞富集试剂盒 | Stemcell Technologies | -- | |
| 诱导重组 | 干扰素β | R&D systems | -- |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | lentiCRISPR-Cas9 | -- | -- |
| SCR7 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | GeneJuice转染试剂 | Merck Millipore | -- |
| 代谢示踪 | 13C6-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 气相色谱-质谱 | 7890A气相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 5975C惰性质谱系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 液相色谱-质谱 | Dionex UltiMate 3000液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 甲酸盐检测 | 甲酸盐检测试剂盒 | Biovision | -- |
| 流式细胞术 | BrdU-FITC抗体 | Thermo Fisher | -- |
| 碘化丙啶溶液 | Sigma Aldrich | -- | |
| Click-iT OPP | Thermo Fisher | -- | |
| 免疫印迹 | PSPH抗体 | Bioconnect | 14513-1-AP |
| 磷酸化CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 4539 | |
| Helios抗体 | Cell Signaling Technology | 42427 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | ThermoFischer Scientific | 31462 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | ThermoFischer Scientific | 31432 | |
| 近红外抗小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 5470 | |
| 近红外抗兔抗体 | Cell Signaling Technology | 5151 | |
| Vinculin抗体 | Sigma Aldrich | V9131 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma Aldrich | A 1978 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学数据整合分析 | Ba/F3细胞克隆数（3个WT和3个R98S）、测序深度、差异分析阈值（FDR<0.1，p<0.01） 阅读提示：Methods中的Datasets和Analysis of differentially expressed transcripts部分，以及Figure 1、2、3的图注。 |
| PSPH表达验证 | 细胞模型（Ba/F3、Jurkat、小鼠lin-骨髓细胞）、检测方法（immunoblot、qRT-PCR）、抗体货号及稀释比例 阅读提示：Methods中的Cell cultures、Immunoblotting和Quantitative RT-PCR部分，以及Figure 2e、4b-d的图注。 |
| 代谢示踪分析 | 13C6-葡萄糖浓度（11.1 mM）、标记时间（48小时）、血清透析、GC-MS/LC-MS参数 阅读提示：Methods中的13C Tracer analysis部分，以及Figure 4e,f和5c,d的图注。 |
| PSPH敲低功能实验 | shRNA序列、敲低效率（40-50%）、细胞系（KE37、DND41、RPMI8402）、检测指标（增殖、凋亡、细胞周期、甲酸盐） 阅读提示：Methods中的Lentiviral vectors、Flow cytometry和Formate assays部分，以及Figure 6的图注。 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系（NSG）、注射细胞数（1×10^6）、注射途径（尾静脉）、移植后监测方法 阅读提示：Methods中的Xenografting in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice部分，以及Figure 7的图注。 |