pre-RC相互作用组鉴定
鉴定与pre-RC复合物相关的新蛋白
在稳定表达Flag/HA标记的ORC1、ORC2、ORCA、CDC6和CDT1的HeLa S3细胞中，从Dignam核提取物进行TAP-TAG纯化，银染和质谱鉴定相互作用蛋白。
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ORC泛素连接酶OBI1促进DNA复制起点激活
The ORC ubiquitin ligase OBI1 promotes DNA replication origin firing.
实验完整度
高包含体外细胞系、体内小鼠模型、蛋白质组学、泛素化生化及功能验证
主要模型
HeLa S3细胞系 U2OS细胞系 NIH 3T3细胞 HCT 116和T98G细胞
重点核对
OBI1沉默使用siRNA靶向编码序列或3′UTR，转染后3天检测 BrdU脉冲标记15分钟，流式细胞术检测DNA合成 DNA梳和DNA伸展实验测量复制叉速度和起点间距 ORC3/5不可泛素化突变体（0K）表达实验 OBI1体外泛素化实验使用E1、E2（UbcH5a）、泛素和ATP
摘要
DNA复制起始是一个两步过程。在细胞周期G1期，ORC复合物、CDC6、CDT1和MCM2–7在复制起点组装，形成前复制复合物（pre-RC）。在S期，激酶活性通过形成（CDC45/MCM2–7/GINS）CMG复合物使复制叉建立。然而，所有潜在起点中只有一部分被激活，其选择机制尚不清楚。在此，我们分析了人类细胞中的pre-RC蛋白质组相互作用组，发现C13ORF7/RNF219（以下称为OBI1，即ORC-泛素连接酶-1）与ORC复合物相关。OBI1沉默导致起点激活缺陷，表现为CMG形成减少，而不影响pre-RC建立。OBI1在S期催化一部分染色质结合的ORC3和ORC5的多单泛素化。重要的是，表达不可泛素化的ORC3/5突变体会损害起点激活，证明它们作为OBI1底物对起点激活的相关性。我们的结果确定了一条参与起点激活的泛素信号通路，并为选择要激活的起点提供了一个候选蛋白。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA复制起点激活的选择机制是什么？OBI1是否参与其中？
- 核心机制
- OBI1作为ORC泛素连接酶，在S期催化染色质结合的ORC3和ORC5多单泛素化，促进CMG形成和起点激活。
- 主要证据
- OBI1沉默减少CMG形成和DNA合成，增加复制叉速度和起点间距；OBI1过表达或体外实验催化ORC3/5泛素化；不可泛素化ORC3/5突变体损害起点激活。
- 研究意义
- 鉴定了一条参与起点激活的泛素信号通路，并提供OBI1作为选择激活起点的候选蛋白。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
OBI1与ORC复合物关联验证
验证OBI1与ORC复合物的相互作用及细胞周期调控
免疫共沉淀/蛋白质印迹确认内源性OBI1与ORC1关联；在U2OS细胞中同步化后释放，分析OBI1表达和染色质结合。
OBI1对细胞增殖和转化影响
评估OBI1在细胞生长和转化中的作用
siRNA沉默OBI1后计数细胞；NIH 3T3细胞中过表达OBI1进行 foci形成和软琼脂生长实验。
OBI1在DNA复制起点激活中的作用
确定OBI1是否影响起点激活而非起点许可
siRNA沉默OBI1后，BrdU脉冲标记流式分析，DNA梳和DNA伸展实验测量复制叉速度、起点间距和密度；染色质分级分离分析复制因子招募。
ORC3/5泛素化状态分析
确定ORC亚基的泛素化类型和细胞周期调控
共表达标记ORC亚基和HA-泛素，免疫沉淀检测泛素化；使用单赖氨酸泛素突变体和UbiCRest分析连接类型；同步化细胞分析细胞周期中ORC3/5泛素化。
OBI1催化ORC3/5泛素化验证
验证OBI1是否是ORC3/5的泛素连接酶
过表达OBI1或突变体，检测ORC3/5泛素化；siRNA沉默OBI1；体外泛素化实验使用纯化的OBI1和体外翻译的ORC3/5。
ORC3/5泛素化对起点激活的功能重要性
测试不可泛素化ORC3/5突变体对起点激活的影响
表达赖氨酸缺失的ORC3/5（0K）突变体，检测BrdU掺入、染色质招募和DNA伸展实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| McCoy's 5A培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| JetPEI转染试剂 | polyplus | -- | |
| Interferin转染试剂 | Polyplus | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| 细胞增殖检测 | 溴脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002 |
| DNA纤维分析 | 碘脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | I7125 |
| 氯脱氧尿苷 | MP Biomedicals | 105478 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 |
| 免疫沉淀 | 抗Flag琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| Flag肽 | Sigma-Aldrich | F3290 | |
| 抗HA琼脂糖珠 | Santa-Cruz | sc-7392 AC | |
| HA肽 | Roche | -- | |
| 蛋白质印迹 | 抗ORC1抗体 | Sigma-Aldrich | PLA0221 |
| 抗ORC2抗体 | Santa-Cruz | sc-13238 | |
| 抗ORC4抗体 | Santa-Cruz | sc-20634 | |
| 抗OBI1/RNF219抗体 | Santa-Cruz | sc-84039 | |
| 抗RFC2抗体 | Abcam | ab88502 | |
| 抗PSF1抗体 | Abcam | ab181112 | |
| 抗DNA聚合酶α抗体 | Abcam | ab176734 | |
| 抗CDC7抗体 | Abcam | ab10535 | |
| 泛素化实验 | N-乙基马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | E3876 |
| 镍亲和珠 | Qiagen | -- | |
| UbiCRest试剂盒 | Boston Biochem | -- | |
| 体外泛素化实验 | TNT网状红细胞体外翻译试剂盒 | Promega | -- |
| DNA梳分析 | YOYO-1荧光染料 | Molecular Probes | -- |
| β-琼脂糖酶 | Sigma Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OBI1沉默实验 | siRNA序列（OBI1和ORC1 SmartPool，对照siGENOME Non-Targeting siRNA #2 D-001210-02）及转染浓度5-10 nM 阅读提示：Methods中Reagents and antibodies及Cell culture, infection and transfection小节 |
| BrdU掺入实验 | BrdU浓度100 nM，脉冲时间15分钟，流式细胞术检测 阅读提示：Methods中Flow cytometry小节 |
| DNA梳分析 | IdU 30 μM 20分钟，CldU 300 μM 20分钟，无中间洗涤；DNA拉伸2 kb/μm 阅读提示：Methods中DNA fibre analysis小节 |
| DNA伸展实验 | IdU 20 μM 15分钟，CldU 200 μM 15分钟；测量超过200个复制叉 阅读提示：Methods中DNA spreading部分 |
| 体外泛素化实验 | OBI1免疫沉淀，ORC3/5体外翻译，E1 100 ng，UbcH5a 1 μM，泛素1 mg/mL，ATP 10 mM，30°C 30分钟 阅读提示：Methods中Ubiquitylation-related assays小节 |
| 细胞同步化 | nocodazole浓度（文中未明确说明），释放时间点 阅读提示：Results中OBI1, an ORC complex binding protein小节及Figure 1f图注 |