患者遗传学分析
鉴定导致综合征的致病基因变异
对5个近亲家系患者进行全外显子测序和Sanger测序验证，发现FAT1纯合移码变异，并进行共分离分析和人群频率过滤。
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FAT1纯合移码突变导致以缺损性小眼球、上睑下垂、肾病和并趾为特征的综合征
Homozygous frameshift mutations in FAT1 cause a syndrome characterized by colobomatous-microphthalmia, ptosis, nephropathy and syndactyly.
实验完整度
高患者家系遗传分析、小鼠和斑马鱼模型、人RPE细胞功能验证，含机制探讨
主要模型
5个近亲家系患者（10例） Fat1敲除小鼠 斑马鱼fat1a突变体 人原代RPE细胞
重点核对
患者FAT1纯合移码变异经WES和Sanger测序验证，并在gnomAD等数据库中缺失 Fat1-/-小鼠E14.5显示完全外显的缺损（n>20） 斑马鱼fat1a morpholino敲低和CRISPR/Cas9突变体显示缺损 RPE细胞中FAT1 shRNA敲低导致ZO-1和β-CATENIN连接破坏及跨上皮电阻降低
摘要
发育过程中视裂融合失败可导致致盲性眼畸形。在此，我们报告一种以面部畸形、缺损性小眼球、上睑下垂和并趾（伴或不伴肾病）为特征的综合征，其与FAT1纯合移码突变相关。我们发现Fat1敲除小鼠和纯合携带截短型fat1a突变的斑马鱼胚胎表现出完全外显的缺损，再现了受累个体中最一致的发育缺陷。在人视网膜色素上皮（RPE）细胞（视裂边缘融合的主要部位）中，FAT1定位于最早形成的细胞间连接处，这与它在脊椎动物眼发育过程中促进视裂融合的作用一致。我们的发现确立了FAT1是人类具有多效性的基因：移码突变导致严重的多系统疾病，而隐性错义突变此前与孤立的肾小球小管肾病相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FAT1纯合移码突变是否导致一种新的多系统综合征，及其在视裂融合中的作用机制。
- 核心机制
- FAT1功能缺失破坏视网膜色素上皮细胞最早的细胞间连接和F-ACTIN组织，导致视裂边缘融合失败；其胞质尾部的VASP/MENA和PDZ结合域参与该过程。
- 主要证据
- 5个家系中鉴定出FAT1纯合移码突变；Fat1敲除小鼠和斑马鱼fat1a突变体再现缺损表型；人RPE细胞中FAT1定位于早期细胞连接，敲低后连接完整性和单层形成受损。
- 研究意义
- 确立了FAT1在脊椎动物眼发育和视裂闭合中的进化保守作用，并揭示了FAT1基因变异的多效性：移码突变导致多系统综合征，而错义突变导致孤立的肾小球小管肾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠模型表型验证
验证FAT1功能缺失是否导致眼部缺损
对Fat1-/-小鼠胚胎进行形态学和组织学分析，检测视裂融合情况。
斑马鱼模型验证
验证fat1a在视裂闭合中的保守作用
使用morpholino敲低和CRISPR/Cas9介导的移码突变使斑马鱼fat1a功能缺失，观察眼部表型。
RPE细胞功能研究
探究FAT1在视裂融合部位细胞连接中的作用
在人原代RPE细胞中敲低FAT1，检测细胞连接、F-ACTIN组织和跨上皮电阻。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子测序 | SureSelect人全外显子试剂盒v5 | Agilent Technologies | -- |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| SureSelect人全外显子试剂盒V4 | Agilent technologies Inc | -- | |
| NimbleGen SeqCap EZ人外显子文库 | Roche NimbleGen Inc. | -- | |
| 实时PCR | TaqMan探针 | Applied Biosystems | -- |
| 7500 Fast实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 斑马鱼实验 | 吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools LLC. | -- |
| CRISPR/Cas9 | HiScribe T7高产率RNA合成试剂盒 | NEB | -- |
| 细胞培养 | Primaria组织培养瓶 | BD Biosciences | -- |
| shRNA敲低 | FAT1 shRNA慢病毒转导颗粒 | Sigma Aldrich | SHCLNV-NM_005245 |
| 对照shRNA慢病毒转导颗粒 | Sigma Aldrich | SHC016H | |
| 跨上皮电阻测量 | EVOM2上皮电压欧姆表 | World Precision Instruments | -- |
| 免疫荧光 | FAT1抗体 | Abcam | ab190242 |
| FAT1抗体 | EMD Millipore | MABC612 | |
| YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| FITC标记ZO-1抗体 | Invitrogen | 33-9111 | |
| 鬼笔环肽 | Abcam | ab176756, ab176753 | |
| Hoechst33342 | -- | -- | |
| Western blot | FAT1抗体 | Abcam | ab190242 |
| YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 磷酸化YAP-Ser127抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| β-ACTIN抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者遗传学分析 | 家系来源、亲缘关系、FAT1变异位点及合子状态 阅读提示：Results 'FAT1 mutations cause a syndromic form of colobomatous microphthalmia' 及 Table 1 |
| 小鼠表型分析 | 小鼠品系背景、胚胎期、基因型鉴定方法 阅读提示：Methods 'Animal breeding and maintenance' 及 'Histological and in situ staining of mouse tissue' |
| 斑马鱼实验 | morpholino序列和浓度、CRISPR靶点、注射剂量、观察时间点 阅读提示：Methods 'Zebrafish embryo manipulation by morpholino and CRISPRcas9' |
| RPE细胞敲低实验 | shRNA序列、转导时间、检测时间点、跨上皮电阻测量方法 阅读提示：Methods 'Cell culture experiments' 及 Figure 3 legend |