建立放疗抵抗的脑转移模型
验证脑转移对WBRT的抵抗性，并建立可模拟该抵抗的体外和体内模型。
使用H2030-BrM和E0771-BrM细胞系建立脑转移模型，使用三种不同分割方案对小鼠进行WBRT，观察肿瘤进展和生存期；同时建立体外培养模型包括肿瘤球、胶质细胞共培养和脑片培养。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于可操作的S100A9/RAGE耐药机制对放射敏感性脑转移瘤进行分层
Stratification of radiosensitive brain metastases based on an actionable S100A9/RAGE resistance mechanism
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型、患者来源组织培养及多个人群队列验证，且包括遗传和药理学功能验证及机制研究。
主要模型
H2030-BrM肺癌脑转移细胞系 E0771-BrM三阴性乳腺癌脑转移细胞系 颅内注射小鼠脑转移模型 患者来源的脑转移瘤组织培养（PDOC）
重点核对
WBRT照射方案：10×3 Gy、3×5.5 Gy或3×3 Gy S100A9敲低或FPS-ZM1处理 肿瘤细胞系：H2030-BrM和E0771-BrM 动物模型：免疫缺陷小鼠（nu/nu）和C57BL/6小鼠 临床队列：肺癌、乳腺癌和黑色素瘤脑转移患者
摘要
全脑放疗（WBRT）是许多脑转移瘤患者的治疗基础；然而，其在预防疾病进展方面的疗效以及相关的毒性，使人们对该方法的临床影响产生了质疑，并强调了对替代治疗的需求。鉴于这些患者的可用治疗方案有限，且对转移灶对WBRT耐药的分子机制了解甚少，我们试图发现可操作的靶点和生物标志物，以帮助完善患者选择。通过对WBRT耐药的脑转移瘤实验性体内模型进行无偏分析，我们确定了脑转移瘤中S100A9–RAGE–NF-κB–JunB通路的激活是这一器官耐药的潜在介质。在体内，通过遗传或药理学方法靶向该通路足以逆转WBRT耐药，并在较低辐射剂量下增加治疗获益。在发生脑转移的原发性黑色素瘤、肺癌或乳腺腺癌患者中，脑病灶内源性S100A9水平与对WBRT的临床反应相关，并强调了血液中S100A9水平作为非侵入性生物标志物的潜力。总的来说，我们提供了一个分子框架，用于个性化WBRT，并通过与放射增敏剂联合使用来提高其疗效，以平衡治疗获益和毒性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脑转移瘤对全脑放疗产生耐药的分子机制是什么？如何识别可能受益于放疗的患者并提高疗效？
- 核心机制
- 脑转移癌细胞在脑微环境中高表达S100A9，通过辐射诱导的RAGE受体激活NF-κB通路，进而介导放疗抵抗。
- 主要证据
- 体内外实验证明S100A9敲低或RAGE抑制剂FPS-ZM1可逆转放疗抵抗；患者样本中S100A9水平与放疗反应相关。
- 研究意义
- S100A9可作为生物标志物指导个性化放疗，FPS-ZM1可作为放射增敏剂，提高WBRT疗效并减少毒性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析鉴定耐药相关基因
识别与放疗抵抗相关的基因表达变化。
对放疗敏感和抵抗的培养条件进行RNA-seq，比较转录组差异，并通过基因集富集分析等确定共同失调的基因，发现S100A9显著上调。
验证S100A9诱导机制
确认S100A9在癌细胞中的表达受微环境因子调控。
通过重组细胞因子刺激和共培养实验，验证星形胶质细胞释放的TGF-α和CXCL1诱导癌细胞表达S100A9。
验证S100A9-RAGE-NF-κB信号通路
证明S100A9通过RAGE受体激活NF-κB通路介导放疗抵抗。
通过检测S100A9对放疗敏感性的影响，以及NF-κB报告实验，验证S100A9敲低后NF-κB活性降低。
遗传和药理学靶向S100A9的体内治疗实验
评估抑制S100A9/RAGE能否增敏放疗并提高生存。
使用shRNA敲低S100A9或给予RAGE抑制剂FPS-ZM1，结合WBRT，监测肿瘤负荷和生存期。
临床样本验证和生物标志物评估
在患者样本中验证S100A9表达与放疗反应的相关性。
通过免疫组化检测脑转移瘤中S100A9表达，并与放疗后肿瘤复发或生存期关联；分析血清S100A9水平与患者生存的关系。
评估FPS-ZM1对正常脑组织的毒性
评估放射增敏剂FPS-ZM1联合放疗是否增加正常脑组织损伤。
对小鼠进行WBRT和FPS-ZM1治疗，通过行为学测试和MRI评估神经功能和脑结构损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因功能实验
体内功能和评估实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| 胶原酶III | -- | -- | |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 重组人S100A9 | R&D Systems | 9254-S9 | |
| 细胞处理 | 重组小鼠TNF-α | Peprotech | 315-01A |
| 重组小鼠干扰素-α | BioLegend | 752802 | |
| 重组TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| 重组KC/CXCL1 | Peprotech | 250-11 | |
| 肿瘤球培养 | Humec培养基 | Gibco | 12753018 |
| 碱性人成纤维细胞生长因子 | Gibco | 13256-029 | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 牛胰腺胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| B27补充剂 | Gibco | 17500-044 | |
| 脑片培养 | 低熔点琼脂糖 | Lonza | -- |
| 膜插件 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 振动切片机 | Leica | -- | |
| 抑制剂处理 | FPS-ZM1 | Selleck Chemicals | S8185 |
| BAY-11-7082 | Selleck Chemicals | S2913 | |
| 免疫荧光 | 抗GFP抗体 | Aves Labs | GFP-1020 |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | ab6326 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗GFAP抗体 | Millipore | MAB360 | |
| 抗S100A9抗体 | Dako | M0747 | |
| 抗JunB抗体 | Cell Signaling Technology | C37F9 | |
| 抗mCherry抗体 | Abcam | ab167453 | |
| 抗Iba1抗体 | Wako | 19-19741 | |
| 抗NIMP-R14抗体 | Abcam | ab2557 | |
| 抗TGF-α抗体 | Abcam | ab9585 | |
| 抗拓扑异构酶IIα抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365916 | |
| 抗转谷氨酰胺酶II抗体 | Cell Signaling Technology | 3557 | |
| 抗CXCR2抗体 | Abcam | ab65968 | |
| 免疫组化 | 抗RAGE抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365154 |
| ELISA | 人S100A9 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY5578 |
| 辅助试剂盒 | R&D Systems | DY008 | |
| 多重免疫分析 | FirePlex-96小鼠关键细胞因子免疫分析面板 | Abcam | ab235656 |
| RNA原位杂交 | 用于Mm-Cxcl1的RNAscope 2.5 VS探针 | ACDbio | 407729 |
| 流式细胞术 | 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | C5138 |
| ACK裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | |
| Percoll | -- | -- | |
| FC阻断剂 | BD Biosciences | 553141 | |
| 抗人CD55-APC抗体 | BD | 555696 | |
| BD固定/打孔试剂盒 | BD | 554714 | |
| 抗MRP14抗体 | BioLegend | 350705 | |
| Influx流式细胞分选仪 | BD | -- | |
| qRT-PCR | RNAeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 | |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6002 | |
| PreAmp超级混合液 | Bio-Rad | 1725160 | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | TruSeq链特异性mRNA样本制备试剂盒 | Illumina | 15031047 |
| HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| scRNA-seq | 脑肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi | 130-095-942 |
| gentleMACS C管 | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo解离器 | Miltenyi | 130-096-427 | |
| 成人脑解离试剂盒 | Miltenyi | 130-107-677 | |
| Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- | |
| Chromium单细胞3'GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | PN-1000075 | |
| NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| Matrigel基质胶 | Corning | 356238 | |
| IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | Caliper Life Sciences | -- | |
| Mark I 30A辐照仪 | JL Shepherd | -- | |
| FPS-ZM1 | Selleck Chemicals | S8185 | |
| PDOC培养 | Neurobasal-A培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103049 |
| N-2补充剂 | Gibco | 17502048 | |
| 神经调节蛋白-1β1 | R&D Systems | 396-HB | |
| 磁共振成像 | 16.4T超高场MRI扫描仪 | Bruker | -- |
| 显微镜成像 | Leica SP5直立共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| AxioScan Z1玻片扫描仪 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| WBRT方案 | 照射剂量、分次方案、照射时间点（IC注射后周数）、设备参数 阅读提示：Methods部分 'Radiotherapy in vivo' 和图1a-c |
| 细胞系与培养条件 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件（如FBS浓度、抗生素） 阅读提示：Methods部分 'Cell culture' |
| S100A9敲低和FPS-ZM1处理 | shRNA靶点序列、转染条件、FPS-ZM1剂量（体内外）、给药途径 阅读提示：Methods部分 'Lentiviral production' 和 'Radiotherapy in vivo' |
| 体外放疗抵抗模型 | 照射剂量（10 Gy）、共培养细胞比例、肿瘤球培养时间、脑片培养条件 阅读提示：Methods部分 'Cell survival', 'Glia cell co-culture', 'Oncosphere generation', 'Brain organotypic cultures' |
| 临床试验队列 | 患者纳入标准、放疗方案（剂量、分割）、S100A9检测方法（IHC评分、ELISA）、随访时间、统计方法 阅读提示：Methods部分 'Patient cohort of WBRT', 'Clinical samples', 'Patient cohort for liquid biopsies' |