构建桥粒斑蛋白张力传感器及对照
生成能够测量DP张力的FRET传感器，并验证其功能。
将F40基张力传感器模块插入DPI和DPII的杆状结构域后，构建DPI-TS、DPII-TS及缺失C端角蛋白结合域的对照DPI-ctrl、DPII-ctrl，并构建荧光标记的野生型DPI-wt、DPII-wt。
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桥粒的机械负载取决于外部应力的大小和方向
Mechanical loading of desmosomes depends on the magnitude and orientation of external stress.
实验完整度
高文献包含体外细胞模型（MDCK和MEK）、多种对照组、FRET张力传感器、FLIM和比率成像、免疫染色、电镜及微管牵拉实验，具备功能与机制验证。
主要模型
MDCK II细胞系 小鼠表皮角质形成细胞（MEK-wt） MEK-KO细胞
重点核对
在MDCK和MEK细胞中表达DPI-TS/DPII-TS及对应截短对照DPI-ctrl/DPII-ctrl，通过FLIM或比率FRET测量张力 使用不同刚度水凝胶（2、4、12、25 kPa）培养MEK细胞，检测DPII张力 微管牵拉实验：对单层细胞施加局部机械牵拉，比较牵拉前、中、后的FRET指数变化 通过免疫染色和电镜验证DP constructs定位及桥粒结构 统计采用线性混合效应模型，考虑同一图像内点之间的依赖性
摘要
桥粒是连接相邻细胞中间丝细胞骨架的细胞间黏附复合物，对哺乳动物组织的机械完整性至关重要。桥粒蛋白突变会导致严重的人类疾病，包括上皮水疱和心肌功能障碍。然而，缺乏其承载负荷性质的直接证据。在这里，我们开发了基于荧光共振能量转移（FRET）的张力传感器来测量桥粒斑蛋白所承受的力，桥粒斑蛋白是一种连接桥粒斑块与中间丝的必需桥粒蛋白。我们的实验表明，在大多数条件下，桥粒斑蛋白不会经历显著的张力，但当细胞暴露于外部机械应力时，它会变得机械负载。应力诱导的桥粒斑蛋白负载是短暂的，并且对施加的组织变形的大小和方向敏感，这与桥粒具有应力吸收功能一致，该功能不同于先前分析的细胞黏附复合物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 桥粒是否承载机械负荷，以及桥粒斑蛋白（DP）在何时、何种条件下经历张力？
- 核心机制
- 桥粒斑蛋白在稳态下不承受显著张力，但当细胞受到外部机械应力时被机械负载，且负载程度取决于应力的大小和方向。
- 主要证据
- 基于FRET的张力传感器在MDCK和MEK细胞中显示DPI/DPII在稳态下无显著张力，而在微管牵拉或软基底（2 kPa）上张力增加；免疫染色和电镜确认传感器正确定位并拯救桥粒形成。
- 研究意义
- 桥粒作为一种应力吸收黏附复合物，能够在不干扰细胞运动和形状变化的情况下承受外部机械应力，有助于理解桥粒相关疾病的分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证传感器在细胞中的定位和功能
确认张力传感器和对照构建体正确定位到桥粒，并能拯救桥粒形成。
在MDCK细胞中表达DPI构建体，在MEK-wt和MEK-KO细胞中表达DPII构建体，进行活细胞成像、免疫染色和电镜分析。
测量稳态下DP张力
检测在细胞迁移、不同密度和桥粒形成等稳态过程中DP是否承受张力。
在MDCK细胞中通过FLIM或比率FRET测量DPI-TS和DPI-ctrl的FRET效率，在MEK-wt中不同时间点测量DPII-TS和DPII-ctrl；并进行药物处理（cytochalasin-D、Y-27632、okadaic acid）。
测试外部机械应力对DP张力的影响
验证外部机械牵拉是否导致DP负载。
使用玻璃微管对表达DPI-TS或DPII-TS的MDCK或MEK单层细胞施加局部牵拉，在牵拉前、牵拉中、牵拉后采集比率FRET图像。
分析应力大小和方向对DP负载的影响
确定DP张力与变形大小（回缩距离）和方向（回缩角度）的关系。
计算每个桥粒点的回缩距离dr和回缩角度αr，将FRET指数差异与dr和αr进行关联分析。
测试软基底对DPII张力的影响
检测细胞黏附于生理相关刚度基底时DPII是否负载。
将表达DPII-TS或DPII-ctrl的MEK细胞接种于不同刚度的水凝胶（2、4、12、25 kPa）上，进行FLIM测量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 低糖DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11885-076 |
| 胎牛血清 | Corning | 35011CV | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Lonza 4D核转染仪 | Lonza | V4XC-1012 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 胶原包被盖玻片 | Cellvis | D35-20-1.5-N | |
| L-15培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | |
| ITS-A添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 51300044 | |
| CnT-Prime培养基 | Cell-N-Tec | -- | |
| Accutase细胞消化液 | Cell-N-Tec | CnT-Accutase-100 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 活细胞成像皿 | Ibidi | 81158 | |
| 指定刚度水凝胶 | Matrigen | SV3520-EC-2/4/12/25 PK | |
| 药物处理 | Y-27632 | Sigma | Y0503 |
| 细胞松弛素D | Sigma | C2618 | |
| 冈田酸 | Cayman Chemical | 10011490 | |
| 免疫染色 | 小鼠抗桥粒斑蛋白I/II抗体 | Abcam | ab16434 |
| 兔抗角蛋白5抗体 | BioLegend | 905501 | |
| 兔抗角蛋白14抗体 | BioLegend | 905301 | |
| 小鼠抗桥粒芯蛋白1/2抗体 | Progen Biotechnik | 61002 | |
| 小鼠抗斑菲素1抗体 | Santa Cruz | sc-33636 | |
| 小鼠抗斑珠蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | 13-8500 | |
| 小鼠抗角蛋白18抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-06326 | |
| 小鼠抗磷酸化肌球蛋白轻链2抗体 | Cell Signaling Technology | 3675 | |
| 抗小鼠IgG Alexa Fluor-647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | |
| 抗小鼠IgG Alexa Fluor-488 | Thermo Fisher Scientific | A21200 | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor-405 | Thermo Fisher Scientific | A31556 | |
| 抗小鼠IgG Alexa Fluor-647 | Cell Signaling Technology | 4410 | |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | |
| ActinRed | Thermo Fisher Scientific | R37112 | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| 透射电子显微镜 | 透射电子显微镜Libra 120 | Zeiss | -- |
| FLIM | Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| MaiTai钛蓝宝石激光器 | -- | -- | |
| Becker & Hickl SPC-150检测系统 | Becker & Hickl | SPC-150 | |
| LCI Plan Apo 40倍水浸物镜 | -- | -- | |
| 带通滤光片475/28 nm | Semrock | 475/28 nm | |
| Leica TCS SP5 X共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS SP5 X | |
| 脉冲白光激光器 | NKT Photonics | -- | |
| FLIM X16 TCSPC检测器 | LaVision Biotech | FLIM X16 | |
| 63倍水浸物镜HCX PL APO CS | Leica | HCX PL APO CS | |
| 带通滤光片545/30 nm | Chroma | 545/30 nm | |
| 比率FRET | 倒置Nikon Ti-E显微镜 | Nikon | -- |
| Micromanager 1.4.22软件 | -- | -- | |
| Heliophor光源 | 89 North | -- | |
| Andor sCMOS Neo相机 | Andor | Neo | |
| CFI Plan Apo Lambda 40倍空气物镜 | Nikon | -- | |
| 微管牵拉 | 玻璃微管 | -- | -- |
| 手动单轴位移台PT1 | ThorLabs | PT1 | |
| 电动单轴位移台MTS50 | ThorLabs | MTS50 | |
| 质粒构建 | QuickChange Lightning定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| Gibson组装试剂盒 | New England Biolabs (NEB) | E2621L | |
| SNAP标签 | NEB | N9183S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | MDCK细胞培养基（低糖DMEM+10% FBS+1%双抗）、多西环素诱导浓度（DPI-ctrl 0.1 μg/mL，DPI-TS 0.5 μg/mL）、MEK细胞培养基（CnT-Prime含0.07 mM CaCl2）、转染试剂（Lipofectamine 3000）及DNA量（4.5 μg cDNA和7.5 μL Lipofectamine用于FRET） 阅读提示：Methods: Cell culture and construct expression |
| 桥粒诱导 | MEK细胞桥粒形成诱导条件：更换为含1.5 mM CaCl2的CnT-Prime培养基，诱导时间（3-5小时、1天、3天） 阅读提示：Methods: Cell culture and construct expression; Results: Generation of isoform-specific desmoplakin tension sensors |
| FLIM成像 | 激发波长（DPI: 860 nm双光子；DPII: 白激光）、滤光片（DPI: 475/28 nm；DPII: 545/30 nm）、物镜（DPI: 40x水浸；DPII: 63x水浸）、温度（37°C，DPII含5% CO2）、图像大小（512x512像素）、扫描速度（DPII: 400 Hz） 阅读提示：Methods: Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) |
| 微管牵拉实验 | 牵拉位移（MDCK: ~50-100 μm；MEK: <20 μm）、牵拉后等待时间（1-5分钟，直至回缩停止至少10秒）、图像采集时间点（Pre、Pull、Post） 阅读提示：Methods: Micromanipulation experiment and recoil analysis; Supplementary Fig. 4 |
| 药物处理 | Y-27632（10 μM，60分钟）、cytochalasin-D（1.5 μM，30分钟）、okadaic acid（50 nM，12小时）及溶剂对照 阅读提示：Methods: Drug treatments |