鉴定RIP2泛素链类型及结构
确定NOD2激活后RIP2上附着的多聚泛素链类型及其连接方式。
用L18-MDP刺激BMDMs，通过TUBE富集泛素化蛋白，进行UbiCRest分析，使用链特异性去泛素化酶（USP2、OTUD3、Cezanne、OTULIN、AMSH、OTUB1、UCHL3、TRABID）消化，免疫印迹检测RIP2及特定泛素链（K63、K48、K27、M1）。
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去泛素化酶MYSM1通过失活RIP2复合物抑制NOD2介导的炎症和组织损伤
The deubiquitinase MYSM1 dampens NOD2-mediated inflammation and tissue damage by inactivating the RIP2 complex.
实验完整度
高包含体外BMDMs模型、体内小鼠腹膜炎和肝损伤模型，以及机制验证如去泛素化酶活性和泛素链分析
主要模型
野生型、Mysm1−/−和Rip2−/−小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） Mysm1−/−和Mysm1fl/fl LysM-Cre小鼠 MDP诱导的腹膜炎和全身性炎症小鼠模型 MDP/GalN诱导的肝损伤小鼠模型
重点核对
BMDMs刺激条件：L18-MDP 200 ng/ml，C12-iE DAP 200 ng/ml，LPS 500 ng/ml 抑制剂处理：GT 500 ng/ml或LCL-161 100 nM预处理18小时 小鼠体内实验：MDP 25 mg/kg体重腹腔注射，GalN 1 g/kg体重腹腔注射 检测时间点：细胞因子mRNA 6小时，分泌蛋白12小时；体内6小时 样本量：BMDMs实验n=3；小鼠实验n=6-12
摘要
NOD2对 Antimicrobial 先天免疫和组织稳态至关重要，但需要严格调控以避免病理。NOD2信号传导的焦点是RIP2，其多聚泛素化后成核NOD2:RIP2复合物，从而启动导致炎症的信号事件，但协调这一过程的多聚泛素的确切性质和调控仍不清楚。在此我们显示NOD2信号涉及RIP2与赖氨酸63（K63）、K48和M1多聚泛素链以及非经典K27链的偶联。此外，我们鉴定MYSM1作为一种近端去泛素化酶，通过选择性去除K63、K27和M1链而保留K48链，从而减弱NOD2:RIP2复合物组装。因此，MYSM1缺陷小鼠具有不受控制的NOD2介导的腹膜炎、全身性炎症和肝损伤。这项研究提供了NOD2:RIP2信号中多聚泛素的完整概况，并揭示MYSM1作为限制这些多聚泛素以防止过度炎症的中心负调控因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NOD2信号传导中RIP2的多聚泛素链类型、结构及其如何被调控以适时终止NOD2信号并避免病理。
- 核心机制
- NOD2激活后RIP2被K63、K48、M1和K27多聚泛素化，其中K63、K27和M1链形成杂合聚合物；MYSM1去泛素化酶选择性去除RIP2上的K63、K27和M1链，保留K48链，从而破坏NOD2:RIP2复合物组装并抑制下游NF-kB和MAPK炎症信号。
- 主要证据
- 通过UbiCRest分析、免疫印迹和免疫共沉淀在BMDMs中鉴定RIP2泛素链类型及MYSM1的作用；Mysm1−/− BMDMs显示增强的细胞因子产生和信号分子磷酸化；体内实验显示Mysm1−/−和Mysm1fl/fl LysM-Cre小鼠对MDP诱导的腹膜炎、全身性炎症和肝损伤更敏感。
- 研究意义
- 提供了NOD2:RIP2信号中多聚泛素的完整概况，并将MYSM1鉴定为限制这些多聚泛素以防止过度炎症的中心负调控因子，为理解NOD2信号调控和炎症性疾病提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证K209在RIP2泛素化中的作用
确定RIP2的K209残基是否为多聚泛素链附着的主要位点。
在Rip2−/− BMDMs中回补全长RIP2或RIP2(K209R)突变体，用L18-MDP刺激，检测泛素化及TNFα反应。
研究MYSM1在NOD2信号中的招募和功能
探究MYSM1是否被招募至NOD2:RIP2复合物并负调控NOD2信号。
用L18-MDP刺激BMDMs，免疫荧光和免疫共沉淀检测MYSM1的亚细胞定位及与RIP2的相互作用；使用Mysm1−/− BMDMs检测细胞因子反应和信号分子磷酸化。
确定MYSM1对RIP2泛素链的切割特异性
验证MYSM1是否选择性去除RIP2上的K63、K27和M1链而不影响K48链。
从Mysm1−/− BMDMs中纯化泛素化RIP2，与重组MYSM1或对照DUBs孵育，免疫印迹检测特定泛素链；使用二泛素验证MYSM1的链特异性。
解析MYSM1的结构域功能
确定MYSM1的SWIRM和MPN结构域在抑制NOD2信号中的作用。
在Mysm1−/− BMDMs中回补MYSM1全长、ΔSWIRM、ΔMPN或SWIRM+MPN融合体，以及催化失活突变体D660N，检测对NOD2:RIP2复合物组装和细胞因子产生的影响。
评估MYSM1在体内的免疫调节作用
验证MYSM1在NOD2介导的炎症和组织损伤中的生理相关性。
对WT、Mysm1−/−和Rip2−/−小鼠以及Mysm1fl/fl和Mysm1fl/fl LysM-Cre小鼠进行MDP诱导的腹膜炎和肝损伤实验，检测中性粒细胞招募、细胞因子和ALT水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗磷酸化RIP2抗体 | Cell signaling technology | 4364 |
| 抗RIP2抗体 | Cell signaling technology | 4142 | |
| 抗磷酸化TAK1抗体 | Cell signaling technology | 9339 | |
| 抗TAK1抗体 | Cell signaling technology | 4505 | |
| 抗磷酸化IKKα/β抗体 | Cell signaling technology | 2078 | |
| 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell signaling technology | 4631 | |
| 抗p38 MAPK抗体 | Cell signaling technology | 9212 | |
| 抗XIAP抗体 | Cell signaling technology | 2042 | |
| 抗H2A抗体 | Cell signaling technology | 12349 | |
| 抗K63泛素链抗体 | Cell signaling technology | 5621 | |
| 抗K48泛素链抗体 | Cell signaling technology | 8081 | |
| 抗MYSM1抗体 | Abcam | ab193081 | |
| 抗HOIP抗体 | Abcam | ab85294 | |
| 抗IKKα/β抗体 | Abcam | ab178870 | |
| 抗K27泛素链抗体 | Abcam | ab181537 | |
| 抗TAB2抗体 | Thermo-Scientific | MA514818 | |
| 流式细胞术 | 抗Ly6G抗体 | Thermo-Scientific | 35-5931-80 |
| Western blot | NuPAGE Novex 4-12% Bis Tris中型蛋白凝胶 | Thermo-Scientific | WG1402 |
| NuPAGE MES SDS电泳缓冲液 | Thermo-Scientific | NP0002 | |
| ECL蛋白质印迹检测试剂盒 | Thermo-Scientific | -- | |
| 抗NEMO抗体 | BD Biosciences | 559675 | |
| 流式细胞术 | 抗CD11b抗体 | BD Biosciences | 553312 |
| UbiCRest分析 | UbiCREST二泛素酶套装 | Lifesensors | K-400 |
| TUBE pulldown | 琼脂糖TUBE 2 | Lifesensors | UM402 |
| 抗K63 TUBE；FLAG | Lifesensors | UM604 | |
| 抗M1线性TUBE；FLAG | Lifesensors | UM606 | |
| Western blot | 抗M1泛素链抗体 | Lifesensors | AB-130 |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| Western blot | 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T3828 |
| ALT活性测定 | ALT活性测定试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK052 |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| 抑制剂处理 | 胶霉毒素 | Sigma-Aldrich | G9893 |
| Western blot | 抗TAB3抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-46550 |
| 抗NOD2抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-30199 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G plus琼脂糖珠 | Santa Cruz biotechnology | sc-2003 |
| Western blot | HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 |
| 山羊抗兔IgG | Santa Cruz biotechnology | sc-2004 | |
| 驴抗山羊IgG | Santa Cruz biotechnology | sc-2020 | |
| 细胞刺激 | L18-MDP | Invivogens | tlrl-imdp |
| 动物实验 | MDP | Invivogens | tlrl-mdp |
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Gibco, Life technology | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Life technology | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| L929条件培养基 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G plus琼脂糖珠 | Santa Cruz biotechnology | sc-2003 |
| 流式细胞术 | LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | NIKON C1共聚焦显微镜 | NIKON | -- |
| qRT-PCR | ABI Prism 7500快速RT-PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| TaqMan基因表达探针 | Applied Biosystems | Mm00443258_m1, Mm00446190_m1, Mm03928990_g1 | |
| ELISA | 小鼠ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | oligo(dT)引物 | New England Biolabs | -- |
| 银染 | 银染试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 质粒构建 | pBabe puro IRES EGFP载体 | Addgene | 14430 |
| 病毒包装 | pCL-Eco包装质粒 | Addgene | 12371 |
| 细胞系 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| 转染 | 聚凝胺 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDMs刺激与抑制剂处理 | L18-MDP浓度（200 ng/ml）、刺激时间（1小时至12小时）、GT浓度（500 ng/ml）及预处理时间（18小时）、LCL-161浓度（100 nM）及预处理时间（18小时） 阅读提示：Methods中“Cell culture and stimulation”小节及Figure legends |
| UbiCRest分析 | 各DUB浓度（USP2 0.5 µM，OTUD3 3 µM，Cezanne 2 µM，UCHL3 3 µM，Trabid 3 µM，OTUB1 10 µM，AMSH 3 µM，OTULIN 1 µM，MYSM1 2 µM）、消化时间（1小时）和温度（37°C） 阅读提示：Methods中“Deubiquitinase assays”小节及Figure 1和Figure 5图注 |
| 小鼠腹膜炎模型 | MDP剂量（25 mg/kg体重）、给药途径（腹腔注射）、分析时间（6小时）、小鼠周龄（8-12周）和样本量（n=6） 阅读提示：Methods中“Animal experiments”小节及Figure 7图注 |
| 小鼠肝损伤模型 | GalN剂量（1 g/kg体重）及预处理时间（4小时）、MDP剂量（25 mg/kg体重）、分析时间（6小时）和样本量（n=8-12） 阅读提示：Methods中“Animal experiments”小节及Figure 7图注 |
| 细胞因子检测 | qRT-PCR检测时间（刺激后6小时）、ELISA检测时间（刺激后12小时）、TaqMan探针（Tnf Mm00443258_m1，Il6 Mm00446190_m1）和内参（Rn18s） 阅读提示：Methods中“ELISA and quantitative real time PCR analysis”小节及Figure 3和Figure 6图注 |