SHMT2乙酰化位点鉴定
确定SHMT2的主要乙酰化位点
Flag-SHMT2在HeLa、U2OS细胞表达并经NAM处理，抗泛乙酰赖氨酸抗体检测；质谱鉴定K95；构建K95R/Q等突变体并用位点特异性抗体验证
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SIRT3对丝氨酸羟甲基转移酶2的去乙酰化促进结直肠癌发生
Deacetylation of serine hydroxymethyl-transferase 2 by SIRT3 promotes colorectal carcinogenesis.
实验完整度
高包含细胞系、Sirt3敲除小鼠、AOM-DSS模型、异种移植瘤及35对和309例患者样本，含多位点突变、泛素化、结构等多层功能与机制验证
主要模型
结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116 Sirt3敲除小鼠及AOM-DSS结直肠癌模型 SW480异种移植瘤裸鼠模型 人结直肠癌组织样本（35对及309例）
重点核对
SHMT2 K95为主要乙酰化位点，K95R/Q突变显著降低整体乙酰化 SIRT3依赖NAD+去乙酰化SHMT2-K95，H248Y突变体无活性 K95乙酰化破坏四聚体并抑制酶活性 K95Q突变经K63-泛素-溶酶体途径降解，TRIM21为E3连接酶 K95Q降低细胞增殖、丝氨酸消耗及NADPH并抑制移植瘤生长
摘要
线粒体中由丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）完成的丝氨酸与甘氨酸转化在多种癌症中显著上调，以支持癌细胞增殖。本研究发现，在结直肠癌（CRC）细胞中SHMT2在K95位点被乙酰化。线粒体主要去乙酰化酶SIRT3负责SHMT2的去乙酰化。SHMT2-K95-Ac破坏其功能性四聚体结构并抑制其酶活性。SHMT2-K95-Ac还以葡萄糖依赖的方式通过K63-泛素-溶酶体途径促进其降解。TRIM21作为SHMT2的E3泛素连接酶。SHMT2-K95-Ac通过减弱丝氨酸消耗和降低NADPH水平，降低CRC细胞增殖和体内肿瘤生长。最后，SHMT2-K95-Ac在人CRC样本中显著降低，并与SIRT3表达升高呈负相关，而SIRT3表达升高与较差的术后总生存期相关。本研究揭示了SHMT2受乙酰化调控的未知机制，该机制参与结直肠癌发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SHMT2的翻译后修饰是否影响其在肿瘤发生中的蛋白水平，以及SHMT2上调如何参与结直肠癌发生。
- 核心机制
- SIRT3去乙酰化SHMT2 K95；K95乙酰化破坏SHMT2功能性四聚体并抑制酶活性，同时经TRIM21介导的K63-泛素-巨自噬-溶酶体途径促进SHMT2降解。
- 主要证据
- 细胞系中位点突变、体外去乙酰化与酶活实验、凝胶过滤及交联实验、泛素化实验、SW480增殖与异种移植瘤实验、AOM-DSS小鼠模型及人结直肠癌样本免疫印迹与免疫组化。
- 研究意义
- 揭示SHMT2受乙酰化调控的机制参与结直肠癌发生，提示靶向SHMT2 K95乙酰化或活性可能为结直肠癌治疗提供方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SIRT3去乙酰化验证
验证SIRT3是否为SHMT2主要去乙酰化酶
免疫共沉淀检测相互作用，体外去乙酰化实验，SIRT3过表达、敲除及敲低，亚细胞分离检测SHMT2-K95-Ac定位
乙酰化对酶活性与四聚体影响
明确K95乙酰化抑制SHMT2活性及破坏四聚体的机制
纯化WT、K95R、K95Q及K95-Ac重组蛋白，稳态动力学分析；K95R晶体结构解析；凝胶过滤、免疫共沉淀及戊二醛交联检测四聚体
乙酰化促进降解途径验证
确定K95乙酰化促进SHMT2降解的途径
CHX追踪蛋白半衰期，NH4Cl、3-MA、MG132处理，Atg5/Atg7敲低，泛素及K48/K63泛素突变体共转染
TRIM21作为E3连接酶验证
鉴定SHMT2的E3泛素连接酶及K63泛素链形成
亲和纯化质谱鉴定TRIM21，验证相互作用，TRIM21 WT与LD突变体、敲低及高糖处理检测SHMT2泛素化与降解
细胞与体内功能验证
验证K95乙酰化对结直肠癌细胞增殖和肿瘤生长的影响
SHMT2敲低SW480回补WT或K95Q，细胞计数、GC-MS检测丝氨酸/甘氨酸、NADPH与ROS检测；裸鼠异种移植；Sirt3 KO小鼠AOM-DSS模型
临床样本相关性分析
分析SHMT2-K95-Ac、SHMT2、SIRT3在结直肠癌中的表达及预后关联
35对新鲜肿瘤与癌旁组织免疫印迹，309例组织芯片免疫组化，Kaplan-Meier生存分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗flag抗体 | Sigma | SAB4301135 |
| 抗HA抗体 | Abcam | 9110 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| 抗Actin抗体 | Beyotime | AA128 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗SHMT2抗体 | Santa Cruz | 25064 | |
| 抗SIRT3抗体 | Cell Signaling Technology | 2627 | |
| 抗TRIM21抗体 | Cell Signaling Technology | 92043 | |
| 抗K63泛素抗体 | Abcam | 179434 | |
| 抗COXIV抗体 | Cell Signaling Technology | 3E11 | |
| 抗ATG5抗体 | Cell Signaling Technology | D5F5U | |
| 抗微管蛋白抗体 | Beyotime | AT819-1 | |
| 抗SHMT2 K95乙酰化抗体 | Shanghai Youke Biotechnology | -- | |
| 药物处理 | 烟酰胺 | Sigma | 72345 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma | M8699 |
| 溶酶体抑制 | 氯化铵 | Sangon Biotech | -- |
| 自噬抑制 | 3-甲基腺嘌呤 | Selleck | 5142-23-4 |
| 甲酸盐回补 | 甲酸钠 | Sigma | 71539 |
| 免疫沉淀 | 抗flag M2琼脂糖 | Sigma | A2220 |
| 酶活检测 | DL-β-苯丝氨酸 | Sigma | 171603 |
| 96孔紫外板 | Corning | 3635 | |
| EPOCH2酶标仪 | BioTek | -- | |
| 蛋白纯化 | BL21 (DE3) | -- | -- |
| 磷酸吡哆醛 | Sigma | P9255 | |
| HisTrap HP镍柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 16/600 FPLC柱 | GE Healthcare | -- | |
| ÄKTA快速蛋白液相色谱系统 | GE Healthcare | -- | |
| 超高压连续流细胞破碎仪 | -- | JN-3000 plus | |
| 定点突变 | KOD-Plus定点突变试剂盒 | TOYOBO | -- |
| 乙酰化蛋白表达 | N-乙酰赖氨酸 | Sigma | A4021 |
| GC-MS | 甲氧胺盐酸盐 | Sigma | 226904 |
| Concentrator Plus浓缩仪 | Eppendorf | -- | |
| GC-MSD系统 | Agilent Technologies | -- | |
| NADPH检测 | NAD(P)H-Glo检测系统 | Promega | G9061 |
| ROS检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | D6883 |
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | BI | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Sangon Biotech | -- | |
| RPMI-1640培养基 | GIBCO | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | GIBCO | -- | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| RT-qPCR | qPCR RT Master Mix含gDNA去除试剂盒 | TOYOBO | -- |
| SYBR Green实时PCR预混液 | TOYOBO | -- | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | 10600002 |
| 细胞计数 | 细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | -- |
| AOM-DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | -- | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SHMT2 K95乙酰化鉴定 | NAM处理浓度为7.5 mM，处理时间各图未统一；K95R/Q为主要位点突变；细胞类型HeLa、U2OS、HCT116 阅读提示：Fig. 1a、1d–1f及Methods的抗体与试剂部分 |
| SIRT3体外去乙酰化 | NAD+ 1 mM、NAM 10 mM预处理10 min、30 °C反应2.5 h；SIRT3-H248Y为催化失活突变 阅读提示：Fig. 1h–1j及Methods的In vitro SHMT2 deacetylation assay |
| SHMT2酶活与四聚体检测 | DL-β-phenylserine 50 mM、pH 8.0、25 °C、279 nm读数；凝胶过滤与0.025%戊二醛交联条件 阅读提示：Fig. 2a–h及Methods的SHMT2 activity assay、Recombinant human SHMT2 expression and purification |
| SHMT2降解途径 | CHX 75 μg/ml、NH4Cl 10或20 mM、3-MA 2 mM、MG132处理；Atg5/Atg7敲低；K48-only与K63-only泛素突变体 阅读提示：Fig. 3及Supplementary Fig. 3、Methods的Antibodies and reagents |
| TRIM21泛素化验证 | TRIM21-LD突变体C16A、C31A、H33W；高糖0或25 mM处理6–12 h 阅读提示：Fig. 4及Methods的shRNA-knockdown、rescued、and overexpression cell pools construction |
| 细胞增殖与异种移植 | SW480细胞4×104/12孔，5天计数；裸鼠2×106细胞皮下注射，6–7周龄雄性，3周后取材 阅读提示：Fig. 5a、5c及Methods的Proliferation assay、Xenograft studies |
| AOM-DSS小鼠模型 | AOM 10 mg/kg腹腔注射，DSS 1.25%–1.5%–1.75%三轮，每轮7天饮水+14天间隔，第65天取材；n=8（WT）、n=9（Sirt3 KO） 阅读提示：Fig. 5f及Methods的AOM-DSS CRC mouse models |
| 临床样本分析 | 35对新鲜样本免疫印迹；309例组织芯片免疫组化评分0–12；SIRT3高表达190例与低表达119例生存分析 阅读提示：Fig. 6及Methods的Colorectal cancer specimen collection、Immunohistochemistry |