Mll5缺陷小鼠构建与表型验证
获得Mll5缺陷小鼠并确认其基本表型。
利用CRISPR/Cas9技术构建Mll5-/-小鼠，导致exon 3缺失8个核苷酸，观察围产期致死、生长迟缓、雄性生育力受损和造血重建能力受损。
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MLL5通过促进STUB1介导的RIG-I降解抑制抗病毒天然免疫应答
MLL5 suppresses antiviral innate immune response by facilitating STUB1-mediated RIG-I degradation.
实验完整度
高含体外细胞模型、Mll5-/-小鼠模型及VSV感染验证，并有共免疫沉淀、泛素化、蛋白降解等功能与机制验证
主要模型
Mll5-/-小鼠及其来源的BMDMs、PMs和MEFs MLL5-/- HEK293T细胞 VSV-GFP感染的细胞与小鼠标本
重点核对
Mll5-/-小鼠基因型鉴定：exon 3缺失8个核苷酸 VSV-GFP感染剂量与途径：1×10^7 pfu/g或1×10^6 pfu/g静脉注射 poly(I:C)和5′-pppRNA转染浓度与时间：1 μg/ml和0.4 μg/ml，6 h MG132和CHX处理浓度与时间：MG132 30 μM或5 μM，CHX 100 μg/ml RIG-I K48多泛素化检测：MG132 5 μM处理12 h后免疫沉淀
摘要
Trithorax组蛋白MLL5是一种重要的表观遗传修饰因子，控制细胞周期进程、染色质结构维持和造血。然而，MLL5在天然抗病毒免疫中是否发挥作用尚不清楚。本研究表明MLL5抑制RIG-I介导的抗病毒免疫应答。感染水疱性口炎病毒的Mll5缺陷小鼠表现出增强的抗病毒天然免疫、降低的发病率和病毒载量。机制上，部分位于细胞质中的MLL5与RIG-I及其E3泛素连接酶STUB1相互作用，促进RIG-I的K48连接多泛素化和蛋白酶体降解。MLL5缺陷减弱RIG-I与STUB1的结合，减少K48连接多泛素化和RIG-I蛋白在细胞中的积累。病毒感染后，核内MLL5蛋白从细胞核转位至细胞质，诱导STUB1介导的RIG-I降解。本研究揭示了MLL5在抗病毒天然免疫应答中前所未有的作用，并为控制病毒感染提示了新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MLL5是否在天然抗病毒免疫中发挥作用及其机制。
- 核心机制
- 细胞质MLL5与RIG-I及STUB1结合，促进STUB1介导的RIG-I K48连接多泛素化和蛋白酶体降解；病毒感染时核内MLL5转位至细胞质。
- 主要证据
- Mll5缺陷小鼠和细胞中RIG-I蛋白积累、K48多泛素化减少；MLL5缺失减弱RIG-I与STUB1结合；MLL5过表达剂量依赖性增加RIG-I K48多泛素化；体外和体内VSV感染实验。
- 研究意义
- 揭示MLL5在抗病毒天然免疫中的新作用，提示其作为控制RNA病毒感染的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MLL5对RLR介导的天然免疫应答的抑制效应
验证MLL5是否选择性抑制RLR介导的I型干扰素和炎性因子产生。
用poly(I:C)、5′-pppRNA、LPS、CpG-B、R848、Pam3、ISD及VSV、SeV、HSV-1刺激WT和Mll5-/- BMDMs、PMs、MEFs，检测Ifn-β、Tnf-α、Il6 mRNA和蛋白分泌。
MLL5对RLR下游信号通路的调控
确定MLL5抑制RLR信号的作用节点。
在WT和Mll5-/- MEFs及HEK293T细胞中检测VSV感染后IRF3和P65磷酸化及核转位；用MAVS、TBK1、IRF3表达质粒与MLL5共转染进行ISRE荧光素酶报告基因实验。
MLL5缺陷对RIG-I蛋白积累和降解的影响
明确MLL5是否通过影响RIG-I蛋白稳定性发挥作用。
检测WT和MLL5-/-细胞中RIG-I、MDA5、MAVS蛋白水平；用CHX和MG132处理检测RIG-I半衰期；用RIG-I敲低验证功能依赖性。
MLL5对RIG-I K48多泛素化的调控
验证MLL5是否促进RIG-I的K48连接多泛素化。
在WT和MLL5-/- HEK293T细胞中转染RIG-I-FLAG，免疫沉淀检测K48多泛素化；共转染K48-ubi-His进行His pull-down；MLL5剂量依赖性过表达检测RIG-I多泛素化。
MLL5与RIG-I、STUB1的相互作用及结构域定位
确定MLL5、RIG-I和STUB1的相互作用及关键结构域。
共免疫沉淀和质谱鉴定RIG-I相互作用蛋白；用截短突变体确定MLL5的SET域和PHD域、RIG-I的CARD域在结合中的作用；核质分离和共聚焦显微镜观察亚细胞定位。
MLL5介导RIG-I与STUB1结合及细胞质MLL5的功能
验证MLL5是否作为衔接蛋白促进RIG-I与STUB1结合，以及细胞质MLL5的必要性。
在WT和MLL5-/-细胞中检测RIG-I与STUB1共免疫沉淀；MLL5剂量依赖性过表达检测RIG-I-STUB1结合；构建MLL5-NLS强制核定位，检测RIG-I降解。
体内VSV感染模型验证MLL5的抗病毒免疫调控
在体内验证MLL5缺陷对VSV感染和免疫应答的影响。
WT和Mll5-/-小鼠静脉注射VSV-GFP，检测血清和肝脏、肺组织细胞因子、病毒滴度和复制、肺组织病理及生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞刺激 | 5′-三磷酸RNA | InvivoGen | tlrl-3prna |
| 聚肌苷酸-聚胞苷酸 | Sigma | P1503 | |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Selleckchem | S2619 |
| Western blot | 抗MLL5抗体 | Abgent | AP14173a |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗Actin抗体 | Sigma | A5316 | |
| 抗HA抗体 | Roche | 11583816001 | |
| 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 3743S | |
| 抗P65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| 抗磷酸化P65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| 抗K48泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 4289 | |
| 抗V5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-271944 | |
| 抗His抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8036 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-20682 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Abcam | ab138449 | |
| 抗MDA5抗体 | Proteintech | 21775-1-AP | |
| 抗MAVS抗体 | Proteintech | 14341-1-AP | |
| 抗IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1-AP | |
| 抗STUB1抗体 | BBI | D154048 | |
| 免疫荧光 | 抗小鼠Alexa Fluor 555 | Invitrogene | A21422 |
| 抗兔Alexa Fluro 488 | Invitrogene | A110081 | |
| ELISA | 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | BioLegend | 439407 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431301 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | eBioscience | 88-7324-88 | |
| RT-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Takara | DRR420A |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG-027 |
| 质谱 | 偶联FLAG特异性单克隆抗体的Sepharose珠 | Sigma | A2220 |
| 3×FLAG肽 | Sigma | F4799 | |
| His pull-down | 镍-次氮基三乙酸珠 | Qiagen | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞刺激与感染 | poly(I:C)和5′-pppRNA的转染浓度、刺激时间；VSV、SeV、HSV-1的MOI；检测指标Ifn-β、Tnf-α、Il6 mRNA和蛋白 阅读提示：Methods Reagents及Fig. 1图注 |
| RIG-I降解实验 | CHX 100 μg/ml和MG132 30 μM的处理时间；RIG-I半衰期检测时间点 阅读提示：Methods Reagents及Fig. 4g, h图注 |
| 泛素化实验 | MG132 5 μM处理12 h；RIG-I-FLAG转染48 h；K48-ubi-His共转染 阅读提示：Methods Ubiquitination assay及Fig. 4i–k图注 |
| 体内VSV感染 | 小鼠周龄6-9周、性别匹配；VSV-GFP剂量1×10^7 pfu/g或1×10^6 pfu/g；静脉注射途径；检测时间12 h、24 h 阅读提示：Methods Viral infection in vivo及Fig. 3b–i图注 |
| MLL5-NLS功能实验 | MLL5-NLS-HA转染量；STUB1-V5 0、400、1000 ng；RIG-I蛋白检测 阅读提示：Fig. 7e, f图注及Methods Plasmid |