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        microRNA-128缺失促进心肌细胞增殖和心脏再生

        Loss of microRNA-128 promotes cardiomyocyte proliferation and heart regeneration.

        作者信息Wei Huang, Yuliang Feng, Jialiang Liang, Hao Yu, Cheng Wang, Boyu Wang, Mingyang Wang, Lin Jiang, Wei Meng, Wenfeng Cai, Mario Medvedovic, Jenny Chen, Christian Paul, W Sean Davidson, Sakthivel Sadayappan, Peter J Stambrook, Xi-Yong Yu, Yigang Wang
        PMID29453456
        期刊Nat Commun
        发布时间2018-02-16
        DOI10.1038/s41467-018-03019-z
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外新生/成年CM模型、多种转基因小鼠模型、MI和AR手术模型，并进行功能与机制验证。

        主要模型

        新生大鼠/小鼠原代心肌细胞 miR-128过表达转基因小鼠（α-MHC-tTA; miR-128TetRE） 心脏特异性miR-128敲除小鼠（Nkx2.5Cre; miR-128fl/fl 和 α-MHCMerCreMer; miR-128fl/fl） 小鼠心肌梗死（MI）模型和新生小鼠心尖切除（AR）模型

        重点核对

        miR-128过表达和敲除小鼠的基因型鉴定及miR-128表达水平验证 心肌细胞增殖指标（Ki67、pH3、Aurora B、EdU）的定量分析 SUZ12、p27、Cyclin E、CDK2的蛋白和mRNA表达水平检测 ChIP-qPCR检测SUZ12、EZH2和H3K27me3在p27启动子的富集 MI后心脏功能（EF、FS、LVDd、LVDs）和纤维化面积评估

        摘要

        心肌梗死（MI）后利用再生疗法补充心肌细胞（CM）群体的目标受到成年CM再生能力有限的阻碍，部分原因在于它们退出细胞周期。在此，我们表明microRNA-128（miR-128）在出生后从增殖向终末分化转变期间在CM中上调。在新生小鼠中，心脏特异性过表达miR-128损害CM增殖和心脏功能，而miR-128缺失通过增强染色质修饰因子SUZ12的表达延长出生后CM的增殖，SUZ12抑制p27（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）表达并激活正性细胞周期调节因子Cyclin E和CDK2。此外，miR-128缺失促进成年CM的细胞周期再进入，从而减少纤维化水平，并减轻MI后的心脏功能障碍。这些结果表明miR-128是内源性CM增殖的关键调节因子，并可能是心脏修复的新治疗靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        miR-128是否调控心肌细胞增殖和心脏再生，以及其分子机制是什么？
        核心机制
        miR-128通过靶向SUZ12，抑制SUZ12介导的PRC2复合物对p27的转录抑制，从而激活Cyclin E和CDK2，促进心肌细胞增殖。
        主要证据
        体外和体内过表达/敲低miR-128改变心肌细胞增殖；荧光素酶报告基因证实Suz12是miR-128直接靶点；ChIP-qPCR显示SUZ12/EZH2/H3K27me3富集于p27启动子；MI后miR-128缺失改善心脏功能并减少纤维化。
        研究意义
        提示miR-128是内源性心肌细胞增殖的关键调节因子，可能成为心脏修复的新型治疗靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        miR-128在出生后心脏发育中的表达分析

        探究miR-128表达是否与心肌细胞退出细胞周期相关。

        收集P1、P7、P28小鼠心脏，通过RNA-seq、qPCR和原位杂交检测miR-128表达；分离P1和P28心肌细胞及心脏成纤维细胞比较表达。

        2

        心肌细胞特异性过表达miR-128对心脏稳态的影响

        验证miR-128过表达是否抑制心肌细胞增殖并导致心功能障碍。

        构建Tet-off转基因小鼠（α-MHC-tTA; miR-128TetRE），在E6撤除Dox诱导miR-128过表达，于P1检测心脏形态、心功能、心肌细胞增殖和凋亡。

        3

        miR-128缺失对出生后心肌细胞增殖的影响

        验证miR-128缺失是否延长出生后心肌细胞增殖窗口。

        构建心脏特异性miR-128敲除小鼠（Nkx2.5Cre; miR-128fl/fl），在P7、P14、P21检测心肌细胞增殖（Ki67、EdU）、肌节解聚和凋亡。

        4

        miR-128靶向SUZ12的机制验证

        验证Suz12是miR-128直接靶基因，并解析下游细胞周期基因调控。

        通过RNA-seq、Western blot、荧光素酶报告基因、ChIP-qPCR和siRNA敲低SUZ12，验证miR-128-SUZ12-p27-Cyclin E/CDK2通路。

        5

        miR-128过表达对新生小鼠心脏再生的影响

        验证miR-128过表达是否抑制新生儿心脏再生。

        对P1 miR-128OE和对照小鼠进行心尖切除（AR），在术后21天评估再生、心肌细胞增殖、心功能和纤维化。

        6

        miR-128缺失对成年心肌细胞增殖和心脏再生的影响

        验证成年期miR-128缺失是否促进心肌细胞增殖并改善MI后心脏修复。

        使用Tamoxifen诱导的α-MHCMerCreMer; miR-128fl/fl小鼠（iKO），在P21或成年后诱导敲除，检测心肌细胞增殖、谱系追踪，并在MI后评估心功能和纤维化。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证模型与表达
        RNA测序定量PCR原位杂交蛋白质印迹
        验证细胞功能变化
        免疫组织化学免疫荧光EdU掺入实验TUNEL实验超声心动图
        验证分子机制
        荧光素酶报告基因实验染色质免疫沉淀-qPCRsiRNA敲低
        评估体内效果
        心肌梗死模型心尖切除模型Masson三色染色
        数据分析与统计
        基因本体富集分析KEGG通路分析Student's t检验单因素方差分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        RNA提取mirVana miRNA分离试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1560
        组织匀浆Bullet Blender Storm匀浆器MIDSCI--
        RNA质量检测2100生物分析仪Agilent Technologies--
        新生大鼠心肌细胞分离新生心肌细胞分离试剂盒Worthington BiochemicalLK003300
        心肌细胞培养纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
        马血清Gibco26050088
        miR-128过表达miR-128模拟物DharmaconC-310957-01-0005
        miR-128抑制miR-128抑制剂DharmaconIH-310957-02-0005
        Suz12敲低靶向Suz12的siRNADharmaconL-040180-00-0020
        成年心肌细胞培养层粘连蛋白Life technologies23017015
        荧光素酶报告基因实验psiCHECK2载体PromegaC8021
        Dual-GloTM试剂盒PromegaE2920
        qPCRRNeasy微型柱试剂盒Qiagen74104
        miScript PCR起始试剂盒Qiagen218193
        ChIP-qPCRDynabeads蛋白GLife Technologies10009D
        SUZ12 (D39F6)抗体Cell Signaling Technology3737
        EZH2 (D2C9)抗体Cell Signaling Technology5246
        H3K27me3 (C36B11)抗体Cell Signaling Technology9733
        Western blotCyclin E (M-20)抗体Santa CruzSC-481
        SUZ12 (D39F6)抗体Cell Signaling Technology3737
        CDK2 (72B2)抗体Cell Signaling Technology2546
        p27 (D69C12)抗体Cell Signaling Technology3686
        GAPDH抗体Sigma-AldrichG9545
        EdU检测Click-iT EdU成像试剂盒Thermo Fisher ScientificC10337
        siRNA体内递送MaxSuppressor体内RNA-LANCEr IIBioo Scientific3410-01
        Tamoxifen诱导他莫昔芬Sigma--
        免疫组化抗cTnT抗体 (13-11)Thermo Fisher ScientificMS-295-P1
        抗Ki67抗体Abcamab15580
        抗EdU抗体Life technologyC10637
        抗磷酸化组蛋白3 (Ser10)抗体Millipore06-570
        Aurora B (35C1)抗体Sigma-AldrichA2606
        WGA染色Alexa Fluo 488偶联的WGAThermo Fisher ScientificW11261

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        miR-128过表达小鼠诱导
        Dox撤除时间（E6）和检测时间点（P1）；对照组为miR-128TetRE小鼠
        阅读提示：Methods 'Generation of mice with conditional overexpression of miR-128' 和 Fig. 2b
        miR-128敲除小鼠构建与诱导
        Nkx2.5Cre或α-MHCMerCreMer介导的敲除；Tamoxifen剂量（0.25 mg/g）和给药方案（第1、3天腹腔注射）
        阅读提示：Methods 'Generation of mice with a conditional deletion of miR-128'
        EdU标记实验
        EdU腹腔注射剂量（200 µg/g）和标记时间点（P7或P14）
        阅读提示：Methods 'EdU pulse-chase experiment' 和 Fig. 3l, n
        心肌梗死（MI）模型
        小鼠性别（雌性）、年龄（8-10周）、LAD结扎位置（距左心耳顶点1 mm）
        阅读提示：Methods 'Myocardial infarction (MI)'
        心尖切除（AR）模型
        手术时间（P1）和检测时间点（术后21天）
        阅读提示：Methods 'Neonatal mouse apex resection' 和 Fig. 6a

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