样本收集与临床分期
纳入不同HBV感染阶段的患者和健康对照，进行临床分期。
从解放军总医院第五医学中心招募CHB和恢复期患者，根据EASL 2017指南分为IT、IA、AR、CR和HC组，收集肝脏活检和外周血样本。
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单细胞RNA测序揭示HBV感染患者不同疾病阶段的肝内和外周免疫特征
Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients
实验完整度
高包含单细胞RNA测序、TCR/BCR分析、流式细胞术、多色免疫组化等多层级验证，以及第二队列验证和临床相关性分析。
主要模型
HBV感染患者肝脏和血液免疫细胞单细胞图谱 肝脏活检组织 外周血单个核细胞
重点核对
单细胞RNA测序样本：来自23名个体（6 IT，5 IA，3 AR，3 CR，6 HC）的46份配对肝和血样本 流式细胞术验证：额外HBV队列（具体样本量文中未明确说明） 多色免疫组化验证：肝脏组织中的Tex与Treg、FCGR3A+巨噬细胞的空间邻近性 临床参数相关性：ALT、AST、组织学分级和分期
摘要
目的：全面了解HBV感染的免疫景观对于实现HBV治愈至关重要。设计：我们对来自23名个体的46对肝脏和血液样本中的243000个细胞进行了单细胞RNA测序，包括6名免疫耐受（IT）、5名免疫活动期（IA）、3名急性恢复期（AR）、3名慢性恢复期（CR）和6名无HBV的健康对照（HC）。在第二个HBV队列中应用了流式细胞术和组织学检测进行验证。结果：IA和AR均以肝内耗竭性CD8+T（Tex）细胞水平高为特征。在IA中，Tex细胞主要来源于肝脏驻留的GZMK+效应记忆T细胞和自我扩增。相比之下，外周CX3CR1+效应T细胞和GZMK+效应记忆T细胞是AR中Tex细胞的主要来源。在IA而非AR中，观察到Tex细胞与调节性CD4+T细胞以及Tex与FCGR3A+巨噬细胞之间存在显著的细胞间相互作用。这种相互作用可能分别通过人类白细胞抗原I类分子及其受体CANX和LILRBs介导，导致抗病毒免疫应答功能障碍。相比之下，CX3CR1+GNLY+中央记忆CD8+T细胞在AR的肝脏和血液中同时扩增，为病毒清除提供了潜在的替代标志物。临床上，肝内Tex细胞与血清丙氨酸氨基转移酶水平和组织学分级评分呈正相关。结论：我们的研究剖析了不同HBV感染阶段的协调免疫反应，为全面理解免疫发病机制和开发有效的治疗策略提供了丰富资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV感染不同临床阶段（IT、IA、AR、CR）肝内和外周免疫细胞组成和功能差异及其与临床参数的关系。
- 核心机制
- 在IA中，Tex细胞主要来源于肝脏驻留的GZMK+效应记忆T细胞和自我扩增；在AR中，外周CX3CR1+效应T细胞和GZMK+效应记忆T细胞是主要来源。IA中Tex与Treg和FCGR3A+巨噬细胞显著相互作用，可能通过HLA-I与CANX和LILRBs介导，导致抗病毒免疫功能障碍。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序显示IA和AR中Tex细胞扩增，TCR追踪显示不同的来源和迁移；CSOmap和免疫组化验证了Tex与Treg和FCGR3A+巨噬细胞的相互作用；相关性分析显示Tex与ALT和组织学分级正相关。
- 研究意义
- 为理解HBV免疫发病机制提供丰富资源，可能为开发新的免疫治疗策略和预测病毒清除的替代标志物提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序及免疫细胞图谱构建
获取肝内和外周免疫细胞的转录组，构建全面的免疫细胞图谱。
对243000个细胞进行5'mRNA、TCR和BCR文库构建及测序，经质控、聚类和注释，识别8个主要细胞簇和60个亚簇。
CD8+ T细胞亚群功能与发育轨迹分析
探索CD8+ T细胞亚群的功能状态、发育轨迹及在不同阶段的动态变化。
通过PAGA和RNA velocity分析发育轨迹，通过STARTRAC分析克隆扩增、迁移和转换。
细胞间相互作用分析
推断免疫细胞间的潜在相互作用和配体-受体对。
使用CSOmap构建3D伪空间并计算细胞间相互作用，识别Tex与Treg及FCGR3A+巨噬细胞间的显著互作。
多色免疫组化验证
在组织原位验证细胞亚群的空间邻近性。
对肝脏活检组织进行多色免疫组化染色，验证Tex (CD8+PD-1+)与Treg (CD4+FOXP3+)及LILRB2+巨噬细胞的空间邻近。
流式细胞术验证
在独立队列中验证关键细胞亚群的频率和表型。
对PBMCs或肝脏细胞进行流式分析，验证CX3CR1+GNLY+ Tcm细胞在AR中的扩增及Tex表型。
临床相关性分析
评估免疫细胞亚群频率与临床参数的相关性。
对17名HBV感染患者的肝内细胞频率与ALT、AST、HBsAg、HBV DNA、组织学分级和分期进行线性回归分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
TCR/BCR分析
细胞间相互作用分析
组织学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 细胞消化 | MACS肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 流式分选 | 抗人CD45抗体 | BioLegend | -- |
| 7-AAD | ThermoFisher | -- | |
| BD FACSAria III流式分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 建库 | 10x Chromium单细胞5'和VDJ文库构建试剂盒V.1.1 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
| 流式分析 | eBioscience破膜/固定试剂盒 | eBioscience | -- |
| BD Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 光谱流式分析 | Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek | -- |
| Brilliant Buffer Plus | eBioscience | -- | |
| 多色免疫组化 | PANO 7-plex免疫组化试剂盒 | Panovue | 0004100100 |
| 抗人CD4抗体 | Zsbio | ZM0418 | |
| 抗人CD8抗体 | CST | CST70306 | |
| 抗人FOXP3抗体 | BioLegend | BLG320202 | |
| 抗人PD-1抗体 | CST | CST43248 | |
| 抗人CD68抗体 | CST | CST76437 | |
| 抗人LILRB2抗体 | R&D | AF2078 | |
| 抗人HLA-B抗体 | ProteinTech | 17260-1-AP | |
| DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与临床分期 | 患者分组（IT、IA、AR、CR、HC），临床参数（ALT、AST、HBV DNA、HBsAg、组织学分级和分期） 阅读提示：Methods: Study subjects, Table 1 |
| 细胞分离 | PBMC和肝脏细胞的分离方法（密度梯度离心、酶消化） 阅读提示：Methods: Sample collection and cell isolation |
| 单细胞RNA测序 | 建库试剂盒（10x Genomics V.1.1），测序平台（Illumina HiSeq 4000） 阅读提示：Methods: Library preparation and sequencing (10x Genomics) |
| 单细胞转录组分析 | Cell Ranger版本（V.3.1.0），参考基因组（GRCh38），质量控制标准（600-10000个基因，线粒体<10%） 阅读提示：Methods: Single-cell RNA-seq data processing |
| TCR/BCR分析 | STARTRAC指数计算（expa, migr, tran） 阅读提示：Methods: TCR/BCR analysis |
| 细胞间相互作用分析 | CSOmap分析参数和版本 阅读提示：Methods: Cell-cell interaction analysis by CSOmap |
| 流式细胞术验证 | 额外验证队列样本（在线补充表1），抗体列表（在线补充表8），流式细胞仪型号（BD Canto II, Aurora） 阅读提示：Methods: Flow cytometric analysis |
| 多色免疫组化验证 | 抗体克隆号（CD4, CD8, FOXP3, PD-1, CD68, LILRB2, HLA-B），组织固定和抗原修复条件 阅读提示：Methods: Multicolour IHC |