临床样本和小鼠中ZIKV感染与IL-1β分泌的关联验证
验证ZIKV感染是否与IL-1β分泌相关。
检测ZIKV感染患者和健康人血清IL-1β水平；A129小鼠感染ZIKV后检测血液病毒滴度和血清IL-1β动态变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
寨卡病毒感染通过促进NLRP3炎症小体组装和白介素-1β分泌诱导宿主炎症反应
Zika virus infection induces host inflammatory responses by facilitating NLRP3 inflammasome assembly and interleukin-1β secretion.
实验完整度
高含患者血清、人PBMC/巨噬细胞、小鼠及敲除模型，并有功能验证和NS5-NLRP3机制验证
主要模型
ZIKV感染患者血清样本 人PBMC和THP-1巨噬细胞 C57BL/6 WT及NLRP3−/−小鼠BMDC/BMDM A129小鼠（IFN-α/β受体缺陷）
重点核对
ZIKV感染患者n=11与健康对照n=13的血清IL-1β水平比较 THP-1巨噬细胞中ZIKV MOI=1感染24、36、48 h及MOI=0.1、0.5、1感染48 h的IL-1β分泌 NLRP3−/−小鼠BMDC/BMDM中ZIKV诱导IL-1β分泌的验证 HEK293T细胞共转染NLRP3、ASC、pro-Casp1、pro-IL-1β及ZIKV NS5后的IL-1β分泌和Casp-1切割 A129小鼠ZIKV 5×10^5 PFU感染及Ac-YVAD-cmk 8 mg/kg腹腔注射后的IL-1β和炎症反应
摘要
寨卡病毒（ZIKV）感染是公共卫生紧急事件，宿主天然免疫对控制病毒感染至关重要。NLRP3炎症小体通过激活caspase-1促进白介素-1β（IL-1β）分泌，在宿主天然免疫应答中发挥关键作用。本文报道，ZIKV在感染患者、人PBMC和巨噬细胞、小鼠以及小鼠BMDC中刺激IL-1β分泌。细胞中敲低NLRP3和小鼠中敲除NLRP3可抑制ZIKV介导的IL-1β分泌，表明NLRP3在ZIKV诱导的IL-1β激活中发挥必不可少的作用。此外，ZIKV NS5蛋白通过与NLRP3结合促进炎症小体复合物组装，是NLRP3激活和IL-1β分泌所必需的。最后，小鼠ZIKV感染激活IL-1β分泌，导致小鼠脑、脾、肝和肾的炎症反应。因此，我们揭示了ZIKV通过促进NLRP3炎症小体复合物组装和IL-1β激活诱导炎症反应的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZIKV感染是否以及如何通过NLRP3炎症小体诱导IL-1β分泌和宿主炎症反应。
- 核心机制
- ZIKV NS5蛋白通过NACHT和LRR结构域直接结合NLRP3，促进NS5–NLRP3–ASC球状复合物组装，激活caspase-1并促进IL-1β成熟和分泌。
- 主要证据
- 患者血清、人PBMC和THP-1巨噬细胞、小鼠BMDC/BMDM及A129小鼠中ZIKV诱导IL-1β分泌；NLRP3敲低/敲除抑制IL-1β分泌；HEK293T共转染和GST pull-down证实NS5与NLRP3结合并促进ASC寡聚化。
- 研究意义
- 揭示了ZIKV NS5调控NLRP3炎症小体的新功能，阐明了ZIKV通过Casp-1介导的IL-1β激活诱导宿主炎症反应的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞模型中ZIKV诱导IL-1β分泌的验证
验证ZIKV能否在免疫细胞中激活IL-1β产生和分泌。
人PBMC、TPA分化的THP-1巨噬细胞和小鼠BMDC分别用ZIKV、LPS或Nigericin处理，检测IL-1β mRNA、分泌蛋白及成熟IL-1β和cleaved Casp-1。
NLRP3炎症小体在ZIKV诱导IL-1β分泌中的必要性验证
验证NLRP3炎症小体组分是否介导ZIKV诱导的IL-1β活化。
在THP-1细胞中稳定表达sh-NLRP3、sh-ASC或sh-Casp-1，检测ZIKV诱导的IL-1β分泌和Casp-1切割；在NLRP3−/−小鼠BMDC和BMDM中验证ZIKV诱导的IL-1β分泌。
ZIKV诱导NLRP3炎症小体组装的形态学验证
验证ZIKV是否促进NLRP3斑点形成和ASC寡聚化。
在THP-1巨噬细胞、稳定表达NLRP3的HeLa和Vero细胞中，用共聚焦显微镜观察NLRP3和ASC亚细胞定位；用Western blot检测ASC寡聚化。
ZIKV复制和蛋白产生对NLRP3炎症小体激活的必要性验证
区分ZIKV复制、蛋白产生和基因组RNA在NLRP3炎症小体激活中的作用。
用UV灭活或热灭活ZIKV、CHX翻译抑制剂、ZIKV基因组RNA转染处理细胞，检测IL-1β分泌和Casp-1切割。
ZIKV NS5蛋白激活NLRP3炎症小体的鉴定
筛选ZIKV蛋白中负责激活NLRP3炎症小体的组分。
在HEK293T细胞中共转染NLRP3、ASC、pro-Casp1、pro-IL-1β及ZIKV Env、Capsid、NS2A、NS2B、NS4B或NS5，检测IL-1β分泌和Casp-1切割；建立稳定表达NS5的THP-1巨噬细胞验证ASC寡聚化。
NS5与NLRP3相互作用及结构域定位
确定NS5是否直接结合NLRP3及其结合结构域。
免疫共沉淀、GST pull-down和酵母双杂交检测NS5与NLRP3、ASC、Casp-1及NLRP3的PYRIN、NACHT、LRR结构域的结合。
NS5促进NLRP3炎症小体复合物组装的机制验证
验证NS5是否通过结合NLRP3促进NS5–NLRP3–ASC复合物组装。
在HEK293T和HeLa细胞中共转染NS5、NLRP3、ASC，用共聚焦显微镜观察亚细胞定位和复合物形态；检测ASC寡聚化。
ZIKV感染小鼠中炎症反应的体内验证
验证ZIKV感染是否通过Casp-1/IL-1β诱导小鼠炎症反应和病理损伤。
C57BL/6 WT和A129小鼠感染ZIKV，给予Ac-YVAD-cmk，检测血清IL-1β、体重、脾指数、脑/脾/肝/肾组织病理和病毒载量、生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- | |
| PBMC分离 | 淋巴细胞分离液 | MP Biomedicals | 50494 |
| 红细胞裂解液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 病毒RNA提取 | E.Z.N.Z.病毒RNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| 病毒RNA定量 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞分化 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 尼日利亚菌素 | InvivoGene Biotech Co., Ltd. | -- |
| 动物实验 | Ac-YVAD-cmk | InvivoGene Biotech Co., Ltd. | -- |
| 细胞处理 | VX-765 | Selleckchem | -- |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma | F3165 |
| 抗GAPDH抗体 | Sigma | G9295 | |
| 抗NLRP3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2225 | |
| 抗ASC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271054 | |
| 免疫荧光 | 抗NLRP3抗体 | Enzo Life Sciences | ALX-804-818 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | 4A Biotech Co. Ltd. | -- | |
| Western blot | 抗活化caspase-1抗体 | Cell Signaling | D5782 |
| 抗成熟IL-1β抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 蛋白定量 | Bradford蛋白定量试剂 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 化学发光图像分析仪 | Fujifilm | LAS-4000 | |
| 免疫共沉淀 | Protein-G琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SYBR RT-PCR试剂盒 | DBI Bio-science | -- | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Novagen | -- |
| ASC寡聚化 | 辛二酸二琥珀酰亚胺酯 | Sigma | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | 支原体检测试剂盒 | ChanGEnome | -- |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | Fluo View FV1000 |
| 实时PCR | Roche LC480实时PCR仪 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本IL-1β检测 | 患者样本来源、n=11与健康对照n=13、ELISA检测方法 阅读提示：Methods 'Clinical specimens and blood samples'及Fig. 1a图注 |
| 细胞感染与刺激 | ZIKV MOI=1感染24/36/48 h或MOI=0.1、0.5、1感染48 h；LPS 1 µg/ml 6 h；Nigericin 2 µM 2 h；ATP 5 mM 30 min或2 h；TPA 60 nM分化12–14 h 阅读提示：Methods 'THP-1 macrophage stimulation'、'Cell lines and cultures'及Fig. 1、2图注 |
| NLRP3敲低/敲除验证 | shRNA靶序列、NLRP3−/−小鼠来源、BMDC/BMDM分化条件 阅读提示：Methods 'Lentivirus production and infection'、'Animal study'及Fig. 2图注 |
| NS5与NLRP3结合实验 | 共转染质粒组合、GST融合蛋白10 µg、孵育时间4 h、酵母双杂交菌株AH109 阅读提示：Methods 'Co-immunoprecipitation assays'、'GST pull-down assays'、'Yeast two-hybrid analyses'及Fig. 4、5图注 |
| 小鼠感染与Ac-YVAD-cmk处理 | 小鼠品系和周龄、ZIKV 5×10^5 PFU、Ac-YVAD-cmk 8 mg/kg腹腔注射30 min、观察时间点 阅读提示：Methods 'Animal study'及Fig. 7、8图注 |