Snail与4E-BP1表达相关性分析
验证癌细胞系和临床标本中Snail与4E-BP1表达是否负相关
对乳腺癌、结肠癌和肺癌细胞系进行Western blot检测Snail与4E-BP1蛋白；对72例人结直肠癌组织芯片进行Snail和4E-BP1免疫组化染色并按免疫反应强度和染色百分比评分
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Snail通过转录抑制4E-BP1决定对mTOR激酶抑制剂的治疗反应
Snail determines the therapeutic response to mTOR kinase inhibitors by transcriptional repression of 4E-BP1.
实验完整度
高涵盖细胞系、临床组织芯片、CRISPR敲除、启动子/ChIP、翻译与多聚核糖体检测及裸鼠移植瘤体内验证
主要模型
人乳腺癌、结肠癌和肺癌细胞系 Snail敲除HCT116和MDA-231细胞 72例人结直肠癌组织芯片 HCT116移植瘤裸鼠模型
重点核对
Snail过表达/敲低细胞中4E-BP1蛋白与mRNA及4E-BP1启动子荧光素酶活性变化 ChIP检测Snail结合4E-BP1启动子三个E-box及突变E-box的荧光素酶报告 mTORkis（AZD8055、INK128）100 nM处理12 h后帽依赖性翻译、4E-BP1-eIF4E结合、多聚核糖体与新生蛋白合成 INK128 1.5 mg/kg每日两次、每周5天、共3周对Snail WT/KO HCT116移植瘤生长及4E-BP1、cyclin D1/D3的影响 vorinostat 50 mg/kg每日一次单用或联合INK128对HCT116移植瘤生长的影响
摘要
4E-BP1表达缺失与肿瘤进展及mTOR抑制剂耐药相关，但肿瘤中4E-BP1下调的机制尚不清楚。本文中我们发现Snail是4E-BP1的强转录抑制因子。我们发现4E-BP1表达在癌细胞系和临床标本中与Snail水平呈负相关。Snail结合人4E-BP1启动子中存在的三个E-box以抑制4E-BP1转录。在缺乏Snail的癌细胞系中异位表达Snail可显著抑制4E-BP1表达，促进多聚核糖体中帽依赖性翻译，并降低mTOR激酶抑制剂的抗增殖作用。相反，遗传学和药理学抑制Snail功能可恢复4E-BP1表达，并通过增强4E-BP1介导的对细胞增殖和肿瘤生长的翻译抑制作用使癌细胞对mTOR激酶抑制剂敏感。我们的研究揭示了肿瘤发生中关键的Snail-4E-BP1信号轴，并为靶向Snail以改善mTOR靶向治疗提供了依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤中4E-BP1表达下调的机制及其对mTOR抑制剂治疗反应的影响尚不清楚，本文探究Snail是否转录抑制4E-BP1并决定mTORkis敏感性。
- 核心机制
- Snail结合人4E-BP1启动子中的三个E-box直接抑制4E-BP1转录，降低4E-BP1后促进eIF4E起始的帽依赖性翻译及cyclin D1/D3翻译，从而减弱mTORkis的抗增殖作用；该过程不依赖AKT/S6K激活。
- 主要证据
- 癌细胞系与72例结直肠癌标本中Snail与4E-BP1表达负相关；启动子报告、E-box突变和ChIP显示Snail直接结合并抑制4E-BP1启动子；帽依赖性翻译、m7GTP结合、共免疫沉淀、多聚核糖体和新生蛋白合成实验显示Snail经4E-BP1调控翻译；4E-BP1回补或敲低逆转Snail对mTORkis敏感性的影响；Snail敲除HCT116移植瘤对INK128更敏感，vorinostat联合INK128显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究揭示肿瘤发生中关键的Snail-4E-BP1信号轴，提出Snail表达可能作为mTOR靶向治疗的预测标志，并为靶向Snail或HDAC以改善mTOR靶向治疗提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Snail调控4E-BP1表达的遗传学验证
确定Snail是否选择性下调4E-BP1的蛋白和mRNA表达
在HEK293、T47D、MCF7和HCT116中稳定表达Snail，在HCT116、MDA-231、SUM149中用两组shRNA敲低Snail，并用CRISPR-Cas9 nickase构建Snail敲除HCT116和MDA-231细胞及回补Snail；检测4E-BP1、4E-BP2、4E-BP3和E-cadherin的蛋白与mRNA
Snail直接抑制4E-BP1启动子
验证Snail是否直接结合4E-BP1启动子E-box并抑制其转录
构建人4E-BP1启动子（−1,555/+233）荧光素酶报告及三个E-box突变体，在表达或敲低Snail的细胞中检测启动子活性；用ChIP检测Snail在E-box1（−1,199/−1,114）、E-box2（−767/−676）、E-box3（−560/−481）和非E-box区域（−384/−228）的结合
Snail调控mTOR/4E-BP1介导的帽依赖性翻译
验证Snail是否通过抑制4E-BP1改变mTORkis对帽依赖性翻译的作用
用双荧光素酶报告检测帽依赖性与IRES介导的帽非依赖性翻译；用m7GTP Sepharose和eIF4E免疫共沉淀检测4E-BP1-eIF4E结合及eIF4F复合物；用蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体分析；用Click-iT AHA检测新生蛋白合成
Snail对mTORkis细胞生长抑制效应的影响
验证Snail是否通过降低4E-BP1降低癌细胞对mTORkis的敏感性
比较高低Snail细胞系对AZD8055和INK128的IC50；在Snail过表达或敲低细胞中检测72 h生长、克隆形成和细胞周期；用4E-BP1回补或敲低验证4E-BP1的中介作用；用AKT1过表达检验AKT依赖性
体内验证Snail/HDAC抑制对mTORki疗效的影响
验证Snail介导的4E-BP1抑制是否在体内降低mTORki疗效，以及HDAC抑制能否增强疗效
用Snail WT或KO HCT116细胞建立裸鼠皮下移植瘤，给予INK128或溶剂；另用HCT116移植瘤测试vorinostat、INK128及联合治疗；检测肿瘤体积、重量及4E-BP1、cyclin D1/D3等蛋白
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | e-Myco Plus试剂盒 | iNtRON Biotechnology | -- |
| 质粒构建 | pLenti6.3慢病毒表达载体 | Invitrogen | -- |
| pGL3基础报告载体 | Promega | -- | |
| 定点突变 | QuikChange XLII定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| 质粒构建 | pcDNA3-HA-AKT1质粒 | Addgene | 73408 |
| p3xFLAG-mSnail质粒 | Addgene | 34583 | |
| 药物处理 | AZD8055 | Selleckchem | -- |
| INK128 | Active Biochem | -- | |
| 伏立诺他 | MedChem Express | -- | |
| 基因沉默 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒shRNA敲低 | pLKO.1载体 | Sigma | -- |
| 非靶向对照shRNA | Sigma | SHC002 | |
| 基因敲除 | pX462载体 | Addgene | -- |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | RNeasy plus mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| qPCR | StepOne实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | pHRL-TK海肾荧光素酶对照载体 | -- | -- |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- | |
| ChIP | Snail抗体 | R&D Systems | AF3639 |
| 蛋白G sepharose/鲑鱼精DNA | Invitrogen | -- | |
| 免疫共沉淀 | eIF4E抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271480 |
| Western blot | p-Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| p-p70S6激酶 (Thr389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| p-S6 (Ser235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| p-4E-BP1 (Thr37/46)抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| p-4E-BP1 (Ser65)抗体 | Cell Signaling Technology | 13443 | |
| p-4E-BP1 (Thr70)抗体 | Cell Signaling Technology | 13396 | |
| 4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| eIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 2067 | |
| Snail抗体 | Cell Signaling Technology | 3879 | |
| Slug抗体 | Cell Signaling Technology | 9585 | |
| Zeb1抗体 | Cell Signaling Technology | 3396 | |
| Cyclin D1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-718 | |
| Cyclin D2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-181 | |
| Cyclin D3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-182 | |
| Twist抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81417 | |
| PTEN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7974 | |
| eIF4G抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-133155 | |
| eIF4A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377315 | |
| E-cadherin抗体 | BD Biosciences | 610181 | |
| β-actin抗体 | Sigma | A5411 | |
| 帽结合实验 | m7GTP Sepharose珠 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 多聚核糖体分析 | 梯度分馏系统 | Biocomp | -- |
| Beckman SW40Ti转子 | Beckman | -- | |
| 蛋白合成检测 | Click-iT AHA（L-叠氮高丙氨酸） | Invitrogen | -- |
| Alexa Fluor 488炔烃 | Invitrogen | -- | |
| Click-iT细胞反应缓冲液试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 细胞生长检测 | Vi-CELL XR 2.03细胞计数仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞增殖检测 | Click-iT EdU成像试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC凋亡检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 免疫组化 | Snail抗体 | Novus Biologicals | NBP1-19529 |
| 4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| 生物素标记山羊抗兔二抗 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶-亲和素复合物 | Vector Laboratories | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 聚乙二醇400 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型与Snail/4E-BP1表达状态 | 细胞系种类及内源Snail、4E-BP1水平；SUM149培养需Ham's F-12加5% FBS、5 µg/ml胰岛素、1 µg/ml氢化可的松；IMR-90与TIG-1用含15% FBS的EMEM 阅读提示：Methods的Cell culture小节；Fig. 1a及图注 |
| Snail过表达、敲低与敲除 | pLenti6.3-Snail慢病毒感染及嘌呤霉素2 µg/ml筛选7–10天；ShSnail_1/ShSnail_2序列见Supplementary Table 2；CRISPR sgRNA靶向Snail外显子1两个位点、间隔约50 bp，单克隆筛选；siRNA 20 nM转染36–48 h 阅读提示：Methods的Plasmids and reagents、Gene silencing及Generation of human Snail KO cell lines小节；Supplementary Tables 1–2 |
| 4E-BP1启动子报告与E-box突变 | 人4E-BP1启动子片段−1,555/+233、小鼠−1,430/+80；三个E-box突变组合；每孔1×10^5细胞共转染0.5 µg报告质粒和0.1 µg pHRL-TK，36 h检测 阅读提示：Methods的4E-BP1 promoter reporter assay小节；Fig. 3a、b、g及图注 |
| ChIP检测Snail结合 | 4–6×10^6细胞、1%甲醛交联15 min；2 µg Snail抗体AF3639或无关IgG；E-box1/2/3及非E-box引物见Supplementary Table 4 阅读提示：Methods的ChIP assay小节；Fig. 3d–f及图注；Supplementary Table 4 |
| mTORkis处理与翻译检测 | AZD8055或INK128 100 nM处理12 h；帽依赖性翻译报告转染后24 h再加药12 h；多聚核糖体分析环己酰亚胺100 µg/ml；AHA 50 µM标记1 h 阅读提示：Methods的Cap-dependent translation assay、Polysome analysis、Protein synthesis assay小节；Fig. 4及图注 |
| 细胞生长与药物敏感性 | 5×10^4细胞接种六孔板，处理72 h；IC50测定药物浓度0–250 nM；常规检测浓度100 nM；n=3技术重复 阅读提示：Methods的Cell growth and proliferation assays小节；Fig. 5a–d及图注 |
| 体内移植瘤与给药 | 雄性无胸腺裸鼠5–6周龄；每只皮下注射3×10^6 HCT116细胞与Matrigel 1:1混合；肿瘤约150–180 mm3随机分组，n=6只/组；INK128 1.5 mg/kg每日一次或两次、每周5天、共3周；vorinostat 50 mg/kg腹腔每日一次、每周5天；INK128溶媒为5% N-甲基-2-吡咯烷酮加15%聚乙烯吡咯烷酮；vorinostat溶媒为10% DMSO、45% PEG400、45%水 阅读提示：Methods的Animal studies小节；Fig. 7a、b、h及图注 |