miR-10b相互作用组鉴定
无偏鉴定miR-10b在胶质瘤细胞中的直接RNA靶标。
在LN229细胞中进行CLEAR-CLIP实验，通过UV交联、Ago2免疫沉淀、接头连接和高通量测序，鉴定miR-10b嵌合体。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
致癌microRNA作为snRNA和剪接调节因子的核功能
A nuclear function for an oncogenic microRNA as a modulator of snRNA and splicing
实验完整度
高包含CLEAR-CLIP互作组、biochemical和成像靶标验证、细胞功能实验、患者样本分析、RNA-seq剪接分析及体内生长实验。
主要模型
胶质瘤细胞系LN229和U251 胶质瘤干细胞GBM4和GBM8 患者来源的胶质母细胞瘤组织 人星形胶质细胞
重点核对
miR-10b与U6 snRNA的结合通过CLEAR-CLIP和iCLIP验证 miR-10b在胶质瘤细胞核内的定位及其与U6的共定位 miR-10b调节U6的修饰、稳定性、构象及SART3/PRPF8结合 miR-10b对CDC42可变剪接和总蛋白水平的影响 CDC42敲低对胶质瘤细胞和GSC生长的影响
摘要
背景：miRNA是已被确立为mRNA稳定性和翻译抑制因子的调节性转录本，并在功能上与癌变相关。miR-10b是与多种癌症相关的关键致癌miRNA之一。恶性胶质瘤对miR-10b表现出特别显著的依赖性。然而，尽管miR-10b靶向治疗具有潜力，但该miRNA研究较少且性质非常规，阻碍了临床转化。方法：我们利用内源性Argonaute结合RNA的共价连接及其高通量RNA测序来鉴定miR-10b相互作用组，并结合生化和成像方法进行靶标验证。这些方法包括与剪接体蛋白的紫外交联和RNA免疫沉淀、胶质瘤细胞和患者来源肿瘤中的miRNA FISH与蛋白免疫荧光的组合、天然Northern印迹以及转录组范围内的可变剪接分析。结果：我们证明miR-10b与U6 snRNA（剪接体机制的核心组分）结合。我们提供了miR-10b与U6直接结合的证据、胶质瘤细胞和肿瘤中miR-10b与U6共定位的原位成像，以及miR-10b与剪接体组分生化共分离的证据。我们进一步证明，miR-10b调节U6的N-6-腺苷甲基化和假尿苷化、U6与剪接因子SART3和PRPF8的结合，并调节U6的稳定性、构象和水平。这些对U6的影响导致全局剪接改变，以小GTPase CDC42亚型比例改变、总体CDC42水平降低以及CDC42介导的对细胞活力的下游影响为例。结论：我们确定了U6 snRNA（剪接体的关键RNA组分）是胶质母细胞瘤中miR-10b的首要靶标。因此，我们提出了miRNA和剪接机制的意外交汇，以及一种主要癌症相关miRNA的新核功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-10b是否通过非常规的核内机制（如结合snRNA）调控胶质瘤细胞的剪接和生长？
- 核心机制
- miR-10b在细胞核内直接结合U6 snRNA，干扰其与SART3和PRPF8的结合，并调节U6的修饰（假尿苷化和m6A）、稳定性及构象，从而影响剪接体组装和全局可变剪接。
- 主要证据
- 通过CLEAR-CLIP鉴定U6为miR-10b的首要靶标，并通过iCLIP、FISH/IF和生化共分离验证结合；功能实验显示miR-10b调节U6水平和修饰，并影响CDC42剪接和细胞活力。
- 研究意义
- 该研究揭示了miRNA调控的新层面，即miRNA可直接作用于snRNA，扩展了miRNA靶标类型，并为理解胶质瘤对miR-10b的依赖性及开发新的治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-10b与U6 snRNA结合验证
验证miR-10b与U6 snRNA的直接结合及亚细胞共定位。
使用iCLIP（针对SART3、PRPF8）、RNA FISH、免疫荧光、细胞分级分离等方法验证miR-10b与U6的结合和核内共定位。
miR-10b对U6功能和代谢的影响
研究miR-10b是否调控U6 snRNA的水平、稳定性、修饰和构象。
通过qRT-PCR、Northern blot、放线菌素D处理、iCLIP（检测假尿苷和m6A）和天然凝胶电泳等方法分析miR-10b过表达或抑制后U6的变化。
转录组剪接分析及CDC42验证
评估miR-10b和U6扰动对全局可变剪接的影响，并以CDC42为代表性基因验证。
对GBM4细胞进行RNA-seq，使用rMATS分析剪接事件；通过qRT-PCR和Western blot验证CDC42亚型变化及蛋白水平。
CDC42介导的细胞功能验证
证实miR-10b通过U6调控CDC42剪接进而影响胶质瘤细胞生长。
使用siRNA敲低CDC42亚型，观察胶质瘤细胞和GSC球体生长、细胞活力及增殖标志物Ki-67的变化；同时过表达CDC42 iso2观察促生长作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | WISENT | -- |
| 胎牛血清 | WISENT | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco | -- | |
| 神经基础培养基 | Gibco | -- | |
| N-2添加剂 | Gibco | -- | |
| B-27添加剂 | Gibco | -- | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | PeproTech | -- | |
| NeuroCult化学解离试剂盒 | Stemcell Technologies | -- | |
| 星形胶质细胞培养基 | ScienCell Research Laboratories | -- | |
| 星形胶质细胞生长添加剂 | ScienCell Research Laboratories | -- | |
| 细胞/组织解离液 | Innovation Cell Technologies, Inc. | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Neuromag 500转染试剂 | OZ Biosciences | -- | |
| RNA提取 | 总RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | 17250 |
| RT-qPCR | miRCURY LNA逆转录试剂盒 | QIAGEN | 339340 |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR试剂盒 | QIAGEN | 339347 | |
| miRCURY LNA引物（U6: YP00203907; miR-10b: YP00205637; miR-125a: YP00204339） | QIAGEN | -- | |
| iScript逆转录超混合液（?） | BIO-RAD | 1708841 | |
| Viia 7实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Northern blot | 高灵敏度miRNA Northern印迹检测试剂盒 | Signosis | NB1001 |
| 链霉亲和素-HRP偶联物 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Boston BioProducts | -- |
| 蛋白定量 | Micro BCA蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Western blot | Bolt Bis-Tris Plus预制胶（4-12%） | ThermoFischer Scientific | -- |
| Immun-Blot PVDF膜（0.2 μm） | BIO-RAD | -- | |
| ECL底物（Supersignal West Pico化学发光底物） | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 抗体 | 抗HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4874S |
| 抗Lamin B抗体 | ABclonal | A16685 | |
| 抗CDC42-iso1抗体 | Millipore | ABN1646 | |
| 抗CDC42-iso2抗体 | Millipore | 07-1466 | |
| 抗CDC42总抗体 | ThermoFisher Scientific | PA1-092 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T9026 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗KI-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | -- | |
| FISH | ViewRNA细胞增强检测试剂盒 | Invitrogen | 88-1900-99 |
| 腔室玻片（8孔） | FALCON | 354118 | |
| miR-10b探针（FISH） | Invitrogen | -- | |
| U6探针（FISH） | Invitrogen | -- | |
| pri-miR-10b探针（FISH） | Biosearch Technologies | -- | |
| 抗PRPF8抗体（用于IF） | ABclonal | A6053 | |
| 抗SART3抗体（用于IF） | GeneTex | GTX107684 | |
| CLEAR-CLIP | 抗Ago2抗体（用于IP） | Millipore | 03-110 |
| 免疫球蛋白G包被磁珠 | Life Technologies | -- | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0236S | |
| T4 RNA连接酶I | NEB | M0204S | |
| 碱性磷酸酶 | Roche | 10713023001 | |
| T4 RNA连接酶2 | NEB | M0242S | |
| QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | -- | |
| iCLIP | 抗假尿苷抗体 | MBL | D347-3 |
| 抗m6A抗体 | Millipore | MABE1006 | |
| 抗Ago泛抗体 | Millipore | MABE56 | |
| 抗LSM8抗体 | Invitrogen | PA5-69098 | |
| 抗LSM4抗体 | ABclonal | A5891 | |
| 抗DHX8抗体 | ABclonal | A14724 | |
| 抗RBM22抗体 | ABclonal | A10025 | |
| 抗SNRNP200抗体 | ABclonal | A6063 | |
| RNA-seq | Ribo-zero rRNA去除试剂盒 | Epicentre | -- |
| NEBNext Ultra定向RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| AMPure XP磁珠系统 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100（安捷伦生物分析仪） | -- | -- | |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | psiCHECK2载体 | Promega | -- |
| Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2920 | |
| 细胞处理 | miR-10b模拟物 | Dharmacon | C-300550-07-0005 |
| 对照模拟物 | Dharmacon | CN-001000-01-05 | |
| miR-10b抑制剂（反义寡核苷酸） | Dharmacon | -- | |
| U6反义寡核苷酸#1 | Dharmacon | -- | |
| U6反义寡核苷酸#2 | Dharmacon | -- | |
| CDC42亚型1特异性siRNA | Dharmacon | -- | |
| CDC42亚型2特异性siRNA | Dharmacon | -- | |
| CDC42总siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-29256 | |
| 对照siRNA | Dharmacon | -- | |
| CDC42过表达质粒 | OriGene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | 细胞系：LN229、U251、GBM4、GBM8等；转染试剂：Lipofectamine 2000或Neuromag 500；oligo浓度：miR-10b mimic/inhibitor 50 nM，U6 ASO 1 nM，siRNA 100 nM 阅读提示：Methods: Cell culture, Oligonucleotides, siRNAs, and cell transfection |
| miR-10b与U6结合验证 | CLEAR-CLIP实验条件（UV剂量、RNase浓度、抗体）；iCLIP抗体（抗SART3、抗PRPF8、抗假尿苷、抗m6A等）；FISH探针（miR-10b、U6） 阅读提示：Methods: CLEAR-CLIP, Crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP), Fluorescence in-situ hybridization (FISH) and immunofluorescence; Results: MiR-10b binds to snRNA U6, miR-10b is a part of the spliceosomal SART3 and PRPF8 RNPs |
| U6功能和代谢分析 | 放线菌素D浓度（5 μg/ml）和处理时间（2-36 h）；Northern blot探针（U6, U2, U4）；iCLIP检测U6修饰（假尿苷、m6A）；天然凝胶电泳条件 阅读提示：Methods: RNA stability and half-life, Denaturing and native northern blot; Results: miR-10b regulates U6 snRNA levels, stability, modifications, and conformation |
| RNA-seq和剪接分析 | GBM4细胞转染条件（miR-10b inhibitor、U6 ASO1及对照，72 h）；RNA-seq文库构建试剂盒和平台；rMATS分析参数；差异剪接事件阈值 阅读提示：Methods: Library constructions, RNA sequencing, and bioinformatics analysis; Results: MiR-10b and U6 regulate alternative splicing of CDC42 |
| CDC42功能验证 | siRNA序列（iso2特异、总CDC42）；转染浓度（100 nM）；细胞活力检测（WST-1）、Ki-67免疫荧光、GSC球体计数 阅读提示：Methods: Cell culture, Oligonucleotides, siRNAs, and cell transfection; Results: MiR-10b and U6 regulate alternative splicing of CDC42; Supplementary Figures 9 and 10 |