全外显子组测序及变异筛选
在EoE家系中鉴定潜在致病变异
对一个多代EoE家系（发现集）和61个多发性EoE家系（重复集）进行全外显子组测序，并通过Sanger测序验证共分离。
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桥粒斑蛋白和周斑蛋白在遗传和功能上促进嗜酸性粒细胞性食管炎
Desmoplakin and periplakin genetically and functionally contribute to eosinophilic esophagitis
实验完整度
高包含家系全外显子组测序、队列验证、患者样本分子与组织学分析、细胞功能实验（屏障、迁移、RhoA活性）、机制研究（CAPN14降解及抑制）等多层级验证。
主要模型
EPC2人食管上皮细胞系（hTERT永生化） HaCaT人皮肤角质形成细胞系 HEK293T人胚肾细胞系 EoE患者食管活检组织
重点核对
全外显子组测序的发现集和重复集家系样本 DSP和PPL变异的Sanger测序验证及共分离分析 EPC2细胞中DSP或PPL敲除（CRISPR/Cas9）及过表达（野生型和突变型） 气液界面培养条件（高钙1.8 mM，5天，再气液界面6天） RhoA活性检测及钙蛋白酶14降解实验（CAPN14共转染和钙离子激活）
摘要
嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）是一种慢性过敏性炎性疾病，具有复杂的潜在遗传病因。在此，我们对一个多代EoE家系（发现集）和另外61个EoE多发性家族（重复集）进行了全外显子组测序。在21%的多发性家族中，发现了编码桥粒相关蛋白DSP和PPL的基因中的一系列罕见的杂合错义变异。携带这些变异的患者食管活检组织即使在疾病缓解期间也保留扩张的细胞间隙，并降低DSP和PPL的表达。这些变异影响食管上皮细胞的屏障完整性、细胞运动性和RhoGTPase活性，并增加对钙蛋白酶14介导的降解的易感性。在非家族性EoE中存在获得性食管DSP和PPL缺失。综上所述，我们揭示了桥粒功能障碍在EoE中的致病作用，为组织特异性过敏反应提供了更深入的机制理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）的罕见遗传变异及其致病机制是什么？
- 核心机制
- DSP和PPL变异导致蛋白对钙蛋白酶14介导的降解敏感性增加，造成屏障功能障碍和RhoGTPase信号异常，从而促进EoE发病。
- 主要证据
- 全外显子组测序发现DSP和PPL罕见变异在EoE家系中富集；患者活检显示DSP/PPL表达降低和结构改变；细胞实验证实变异影响屏障完整性和迁移，并增加CAPN14降解；RhoA活性降低。
- 研究意义
- 该研究揭示了桥粒功能障碍在EoE中的致病作用，为靶向屏障功能和钙蛋白酶抑制剂的治疗策略提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
变异关联和负担分析
评估DSP和PPL罕见变异在EoE中的富集程度
使用ExAC和UK Biobank对照进行罕见变异负担分析，比较DSP/PPL变异频率。
患者食管活检样本分析
评估DSP和PPL表达及组织学特征与疾病状态的关系
分析EoE患者和对照的食管活检，进行qPCR、Western blot、免疫荧光、组织学评分及单细胞RNA测序。
细胞功能实验（DSP/PPL缺失和变异）
验证DSP和PPL对食管上皮屏障和运动功能的影响
在EPC2细胞中通过CRISPR/Cas9敲除DSP或PPL，或过表达突变体，检测气液界面培养下的屏障（TEER、FITC-右旋糖酐）和迁移（伤口愈合）。
RhoA活性检测
研究DSP/PPL变异对RhoGTPase信号的影响
测量过表达野生型或突变型DSP/PPL的EPC2细胞中GTP结合RhoA的水平，并用Rho激活剂或抑制剂处理。
钙蛋白酶14介导的降解实验
探究EoE相关变异是否增加对CAPN14降解的敏感性
在HEK293T细胞中共转染DSP或PPL（野生型或突变型）与CAPN14，并通过钙离子激活，检测蛋白降解；并用钙蛋白酶抑制剂SNJ-1945处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞测序
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | QIAamp DNA血液微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| OG-500唾液采集器 | DNA Genotek | -- | |
| 全外显子组测序 | TruSeq捕获试剂盒 | Illumina | -- |
| HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- | |
| Sanger测序 | Phusion DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- |
| Proflex PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA提取 | miRNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNAlater保存液 | Qiagen | -- | |
| 逆转录 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| qPCR | TaqMan通用预混液II | Applied Biosystems | -- |
| TaqMan探针 | -- | DSP: Hs00189422_m1; PPL: Hs00160312_m1 | |
| Quant Studio 7实时定量PCR仪 | Life Technologies | -- | |
| 单细胞RNA测序 | 10X genomics芯片 | 10X Genomics, Inc. | -- |
| 免疫荧光 | DSP一抗 | Santa Cruz | sc-390975 |
| PPL一抗 | Abcam | ab131269 | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | -- | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | -- | |
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | Lonza | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | pX459M2质粒 | CCHMC Transgenic Mouse and Gene Editing Core Facility | -- |
| Viromer Red转染试剂 | Origene | -- | |
| Quick gDNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 病毒包装 | Lenti-X浓缩液 | -- | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 屏障功能检测 | FITC-右旋糖酐 | Sigma-Aldrich | -- |
| EVOM2电阻仪 | World Precision Instruments | -- | |
| 荧光酶标仪 | BioTek | -- | |
| 伤口愈合实验 | μ培养皿35mm高ibiTreat，4孔培养插入件 | Ibidi USA | -- |
| EVOS倒置显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RhoA活性检测 | RhoA G-LISA激活检测试剂盒 | Cytoskeleton | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 钙蛋白酶降解实验 | TransIT-LT转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| SNJ-1945钙蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NuPAGE Bis-Tris预制胶 | Life Technologies | -- | |
| Odyssey CLx成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| DSP一抗 | R&D Systems | MAB9080 | |
| PPL一抗 | Abcam | ab131269 | |
| FLAG一抗 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| GAPDH一抗 | Abcam | ab181602 | |
| GAPDH一抗 | Origene | TA802519 | |
| HSP90一抗 | Abcam | ab13495 | |
| HSP90一抗 | Origene | TA500494 | |
| IRDye 680RD驴抗小鼠二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| IRDye 800CW驴抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| SNP基因分型 | TaqMan探针CAPN14 (rs10192210) | Applied Biosystems | C___8374570_20 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全外显子组测序 | 测序平台、平均测序深度、比对和变异过滤参数 阅读提示：Methods: Whole-exome sequencing (WES) and WES variant filtering |
| 患者活检样本处理 | 活检部位（远端食管）、RNA提取方法、EoE诊断阈值（≥15 eos/hpf）、活性与非活性定义 阅读提示：Methods: Molecular expression and histologic analysis by esophageal biopsies |
| DSP/PPL表达分析 | qPCR探针、内参基因（GAPDH）、样本量、统计方法 阅读提示：Methods: PCR amplification of DSP, PPL, and representative EoE gene analysis |
| 细胞培养和基因编辑 | 细胞系（EPC2）、培养基、CRISPR/Cas9靶点、转染试剂、筛选浓度（嘌呤霉素） 阅读提示：Methods: Cell culture and Generation of DSP or PPL gene-deficient EPC2 cells using CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis |
| 屏障功能检测 | ALI培养时间、TEER测量设备、FITC-右旋糖酐浓度和分子量 阅读提示：Methods: Transepithelial electrical resistance (TEER) and fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran flux measurements |
| 伤口愈合实验 | 细胞密度、创面宽度、观察时间点（8h或12h）、定量方法 阅读提示：Methods: Wound healing assay |
| RhoA活性检测 | 细胞处理、裂解方法、G-LISA试剂盒、蛋白上样量 阅读提示：Methods: Active RhoA assay |
| 钙蛋白酶降解实验 | 转染方法、CAPN14表达质粒、钙离子浓度、孵育时间、抑制剂浓度 阅读提示：Methods: Calpain-14–mediated degradation assay |