有限再生能力的涡虫中前部再生能力的恢复

Restoration of anterior regeneration in a planarian with limited regenerative ability.

作者信息James M Sikes, Phillip A Newmark
PMID23883929
期刊Nature
发布时间2013-08
DOI10.1038/nature12403

实验完整度

高

包含转录组测序、qRT-PCR、RNAi功能验证、原位杂交、免疫组化及组织学等多层证据

主要模型

Procotyla fluviatilis成虫 Reg+与Reg−组织片段

重点核对

RNAi敲低Pf-β-catenin1后Reg−片段再生头部(n=64/71) 对照(RNAi)动物无芽基或神经结构形成 Pf-APC(RNAi)导致尾部再生(n=14/53) RNAseq中Pf-wnt11-1在Reg−组织中上调约400倍 qRT-PCR验证Pf-sFRP1和Pf-ndk在Pf-β-catenin1(RNAi)后显著上调

摘要

动物间再生潜能的变异性长期困扰着生物学家。基于其惊人的再生能力,涡虫已成为理解再生分子基础的重要模型;然而,也存在再生能力有限的涡虫物种。尽管理解近缘的再生与非再生生物之间的差异很重要,但很少有研究关注再生的进化丧失,导致这种再生丧失的分子机制仍不清楚。本文中,我们研究了Procotyla fluviatilis,一种替换缺失组织能力受限的涡虫,利用下一代测序来定义在允许再生和再生缺陷组织中活跃的基因表达程序。我们发现Wnt信号在再生缺陷组织中被异常激活。值得注意的是,在再生缺陷区域下调经典Wnt信号可恢复再生能力:在通常永不再生的组织中,芽基形成并再生出新的头部。这项工作揭示,操纵单一信号通路可以逆转再生潜能的进化丧失。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
Procotyla fluviatilis再生缺陷组织中的再生失败发生在哪个阶段,其分子机制是什么?
核心机制
再生缺陷组织中Wnt信号异常激活,抑制经典Wnt信号(通过敲低Pf-β-catenin1)可重新激活前部再生程序,恢复头部再生。
主要证据
转录组测序显示Reg−组织中Wnt配体和受体转录本过表达;RNAi敲低Pf-β-catenin1后Reg−片段形成芽基并再生出头和脑(n=64/71),且前部极性基因Pf-sFRP1和Pf-ndk上调。
研究意义
表明操纵单一信号通路可逆转再生潜能的进化丧失,为理解再生丢失的进化及恢复再生缺陷动物的再生能力提供了前景。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

表征再生能力差异

确认P. fluviatilis前部再生缺陷的表型

在Reg+和Reg−区域切断涡虫,观察10天后头部再生情况

2

检测早期再生过程

确定再生失败发生的阶段

组织学和电镜观察伤口愈合,免疫组化检测有丝分裂,原位杂交检测极性基因表达

3

比较转录组分析

鉴定Reg+和Reg−组织中断肢后的差异表达基因

对断肢后24小时的Reg+和Reg−组织片段进行RNAseq,并与完整动物相应区域比较

4

功能验证Wnt信号通路

检验Wnt信号异常激活是否导致再生失败

通过RNAi敲低Pf-β-catenin1或APC,观察Reg−片段的再生表型

5

检测极性基因表达变化

验证Wnt信号抑制后前部极性程序是否重新激活

qRT-PCR检测Pf-β-catenin1(RNAi)和Pf-APC(RNAi)后Reg−组织中极性基因表达

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗突触蛋白小鼠单克隆抗体Developmental Studies Hybridoma Bank3C11
抗磷酸化组蛋白H3(Ser10)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology3377
山羊抗小鼠Alexa-488Molecular Probes, InvitrogenA11029
山羊抗兔Alexa-488Molecular Probes, InvitrogenA11029
Araldite/Embed 812包埋树脂Electron Microscopy Sciences--
甲苯胺蓝----
Cytoseal 60封片剂Thermo Scientific--
TRIzol试剂Invitrogen--
RNA清洁浓缩试剂盒Zymo--
iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad--
pJC53.2载体----
快速DNA连接试剂盒Roche--
Nanoject II显微注射器Drummond Scientific--
Power SYBR Green PCR预混液Applied Biosystems--
7900HT实时PCR系统Applied Biosystems--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物培养
培养温度18°C,饲料喂养频率每两周一次,实验前饥饿1周
阅读提示:Methods中Animal collection & culture小节
RNAi注射
dsRNA浓度约1 μg/μL,注射体积65 nL,注射次数3次/周,注射部位肠道
阅读提示:Methods中RNAi小节
RNAseq
断肢后24小时取材,5条蠕虫组织片段,变化阈值≥2倍且p<0.05
阅读提示:Methods中Transcriptome sequencing and RNAseq小节
qRT-PCR
三个生物学重复,每个样本三次技术重复,以Pf-actin归一化
阅读提示:Methods中Quantitative RT-PCR小节
原位杂交
固定条件:4%甲醛25分钟,还原液5分钟,6% H2O2漂白1小时
阅读提示:Methods中In situ hybridization小节