表征再生能力差异
确认P. fluviatilis前部再生缺陷的表型
在Reg+和Reg−区域切断涡虫,观察10天后头部再生情况
Restoration of anterior regeneration in a planarian with limited regenerative ability.
包含转录组测序、qRT-PCR、RNAi功能验证、原位杂交、免疫组化及组织学等多层证据
Procotyla fluviatilis成虫 Reg+与Reg−组织片段
RNAi敲低Pf-β-catenin1后Reg−片段再生头部(n=64/71) 对照(RNAi)动物无芽基或神经结构形成 Pf-APC(RNAi)导致尾部再生(n=14/53) RNAseq中Pf-wnt11-1在Reg−组织中上调约400倍 qRT-PCR验证Pf-sFRP1和Pf-ndk在Pf-β-catenin1(RNAi)后显著上调
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确认P. fluviatilis前部再生缺陷的表型
在Reg+和Reg−区域切断涡虫,观察10天后头部再生情况
确定再生失败发生的阶段
组织学和电镜观察伤口愈合,免疫组化检测有丝分裂,原位杂交检测极性基因表达
鉴定Reg+和Reg−组织中断肢后的差异表达基因
对断肢后24小时的Reg+和Reg−组织片段进行RNAseq,并与完整动物相应区域比较
检验Wnt信号异常激活是否导致再生失败
通过RNAi敲低Pf-β-catenin1或APC,观察Reg−片段的再生表型
验证Wnt信号抑制后前部极性程序是否重新激活
qRT-PCR检测Pf-β-catenin1(RNAi)和Pf-APC(RNAi)后Reg−组织中极性基因表达
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫染色 | 抗突触蛋白小鼠单克隆抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 |
| 抗磷酸化组蛋白H3(Ser10)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3377 | |
| 山羊抗小鼠Alexa-488 | Molecular Probes, Invitrogen | A11029 | |
| 山羊抗兔Alexa-488 | Molecular Probes, Invitrogen | A11029 | |
| 组织学 | Araldite/Embed 812包埋树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| 甲苯胺蓝 | -- | -- | |
| Cytoseal 60封片剂 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA纯化 | RNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 克隆 | pJC53.2载体 | -- | -- |
| 快速DNA连接试剂盒 | Roche | -- | |
| RNAi | Nanoject II显微注射器 | Drummond Scientific | -- |
| qRT-PCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| 7900HT实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物培养 | 培养温度18°C,饲料喂养频率每两周一次,实验前饥饿1周 阅读提示:Methods中Animal collection & culture小节 |
| RNAi注射 | dsRNA浓度约1 μg/μL,注射体积65 nL,注射次数3次/周,注射部位肠道 阅读提示:Methods中RNAi小节 |
| RNAseq | 断肢后24小时取材,5条蠕虫组织片段,变化阈值≥2倍且p<0.05 阅读提示:Methods中Transcriptome sequencing and RNAseq小节 |
| qRT-PCR | 三个生物学重复,每个样本三次技术重复,以Pf-actin归一化 阅读提示:Methods中Quantitative RT-PCR小节 |
| 原位杂交 | 固定条件:4%甲醛25分钟,还原液5分钟,6% H2O2漂白1小时 阅读提示:Methods中In situ hybridization小节 |