CircCD44 plays oncogenic roles in triple-negative breast cancer by modulating the miR-502-5p/KRAS and IGF2BP2/Myc axes
包含RNA测序、体外细胞功能实验、RNA pulldown/RIP/荧光素酶验证分子互作、动物体内成瘤及转移模型，并进行临床样本相关性分析，具有多个独立证据层级。
TNBC细胞系（MDA-MB-231、BT-549、Hs578T） 皮下异种移植瘤模型 肺转移模型 临床TNBC组织样本（36例TNBC及配对正常组织）
circCD44敲低与过表达稳定细胞系的构建，以及shRNA序列验证 miR-502-5p结合位点突变体（circCD44 mut）和IGF2BP2结合位点突变体 RNA pulldown、RIP、双荧光素酶报告基因验证相互作用 体内异种移植和肺转移模型中的肿瘤生长和转移评估 患者样本中circCD44与预后、miR-502-5p及KRAS/Myc表达的相关性分析
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定TNBC中异常表达的circRNAs，并验证circCD44的环状结构、细胞定位和表达差异。
对5对TNBC及癌旁正常组织进行circRNA测序，筛选出差异表达的circCD44；通过Sanger测序、FISH、细胞分级qRT-PCR和Northern blot验证其环状性、细胞质定位及对RNase R的抗性；在36例TNBC、27例非TNBC及配对的正常组织中检测circCD44表达水平，并分析其与预后的相关性。
明确circCD44对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及化疗耐药的影响。
构建circCD44稳定敲低和过表达的细胞系，通过CCK-8、集落形成、EdU、流式凋亡、划痕愈合、Transwell迁移/侵袭实验评估细胞行为变化；通过免疫印迹检测凋亡相关蛋白和EMT标志物。
验证circCD44与miR-502-5p的直接结合，并阐明其对KRAS表达和信号通路的影响。
利用生物信息学工具预测miR-502-5p结合位点，构建circCD44突变体；通过FISH共定位、RNA pulldown、双荧光素酶报告基因实验验证结合；检测circCD44改变后miR-502-5p和KRAS的表达水平，并进行回复实验验证miR-502-5p介导的KRAS降解。
验证circCD44与IGF2BP2的直接结合，并探讨其调节Myc表达和mRNA稳定性的机制。
通过RNA pulldown结合LC-MS鉴定IGF2BP2为相互作用蛋白，并通过RNA pulldown和RIP验证；利用分子对接预测结合位点并构建突变体；检测circCD44改变后Myc的表达和mRNA半衰期；通过m6A RIP实验检测circCD44对Myc mRNA m6A修饰的影响。
在动物模型中评估circCD44对肿瘤生长和转移的影响。
将稳定敲低或过表达circCD44的TNBC细胞接种至BALB/c裸鼠皮下及尾静脉，评估皮下肿瘤生长和肺转移情况；通过HE染色、流式细胞术检测循环肿瘤细胞（CTCs）和RT-qPCR检测人LINE1评估转移。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | -- |
| MEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Life Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | -- |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | V35113 |
| EdU检测 | EdU标记试剂 | Beyotime | C0071S |
| 双荧光素酶报告基因 | psiCheck2载体 | Promega | -- |
| LC-MS分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 流式分析 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| RT-PCR | PureLink RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYBR Select预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA pulldown | Pierce™ RNA 3'末端脱硫生物素化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20163 |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗体 | N-钙黏蛋白抗体 | CST | 13116 |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 14472 | |
| 增殖细胞核抗原抗体 | CST | 13110 | |
| Slug抗体 | CST | 9585 | |
| Snail抗体 | CST | 3879 | |
| 波形蛋白抗体 | CST | 5741 | |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 3700 | |
| KRAS抗体 | CST | 67648 | |
| 磷酸化AKT (473)抗体 | CST | 4060 | |
| 磷酸化AKT抗体 | CST | 9275 | |
| IGF2BP2抗体 | CST | 14672 | |
| HA标签抗体 | CST | 5017 | |
| CD44抗体 | BD Pharmingen | IM7 | |
| C-myc抗体 | CST | 18583 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA测序分析 | TNBC及配对正常组织样本量（5对）；差异circRNA筛选阈值（fold change >2, p<0.01, FDR<0.05）；测序数据出处（NCBI SRP266211）。 阅读提示：见Methods中RNA sequencing部分。 |
| circCD44敲低与过表达 | shRNA靶序列（两种）；circCD44表达载体及突变类型（miR-502-5p结合位点突变、IGF2BP2结合位点突变）；转染试剂及条件。 阅读提示：见Methods中Plasmid and stable cell line construction部分及图4A、6F。 |
| RNA相互作用验证 | RNA pulldown使用的连接特异性探针序列；RIP实验所使用的抗体（IGF2BP2、m6A）；双荧光素酶报告基因中KRAS 3'UTR的序列和插入方式。 阅读提示：见Methods中RNA pulldown、RNA immunoprecipitation、Dual luciferase activity reporter system部分及图4D、6C、7H。 |
| 体外功能实验 | 细胞系（MDA-MB-231、BT-549、Hs578T）；细胞培养条件（培养基、FBS浓度）；细胞接种密度、处理时间、检测时间点（如CCK-8、集落形成14天、EdU 2小时孵育）。 阅读提示：见Methods中Cell lines、Cell proliferation assay、Colony formation assay、EdU assay部分。 |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别和年龄（4周龄雌性BALB/c裸鼠）；细胞接种量（皮下5×10^6，尾静脉5×10^3）；观察时间（6周）；转移评估方法（HE染色、CTC流式、LINE1检测）。 阅读提示：见Methods中Animal studies和Flow cytometry部分。 |
