多组学数据采集
表征角质形成细胞分化过程中的染色质和表达动态。
收集原代人角质形成细胞，在钙诱导分化过程中多个时间点进行ATAC-seq、ChIP-seq、PAS-seq和HiChIP实验。
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表皮分化的动态、组合顺式调控词汇表
The dynamic, combinatorial cis-regulatory lexicon of epidermal differentiation
实验完整度
高包含多组学数据（ATAC-seq、ChIP-seq、PAS-seq、HiChIP）、深度学习建模、MPRA验证、ChIP-ReChIP、报告基因及类器官模型，功能与机制验证并存。
主要模型
原代人角质形成细胞（钙诱导分化） 人表皮类器官 患者皮肤样本（用于疾病关联分析）
重点核对
原代人角质形成细胞分离自新鲜手术丢弃的新生儿包皮，在角质形成细胞-SFM和Medium 154中培养，汇合后12小时添加1.2 mM钙诱导分化。 ATAC-seq在13个时间点（每12小时）进行，ChIP-seq和HiChIP在0、3、6天进行。 MPRA文库包含77,090个序列，使用慢病毒转导至角质形成细胞，在0、3、6天收获。 深度学习模型使用十折染色体交叉验证，迁移学习预训练于431个细胞类型/组织的DNase-seq数据。 统计检验：使用Wilcoxon符号秩检验评估MPRA轨迹和相互作用，FDR阈值用于差异分析。
摘要
转录因子在顺式调控元件中结合DNA序列基序词汇表，以调节细胞状态转换过程中的染色质状态和基因表达。由于顺式调控编码的组合性质，对基序词汇表如何影响动态调控活性的定量理解一直难以实现。为了解决这个问题，我们进行了跨表皮分化的染色质和表达动力学的多组学数据剖析，以识别与3,609个动态表达基因相关的40,103个动态顺式调控元件，然后应用一个可解释的深度学习框架来模拟染色质可及性的顺式调控逻辑。该分析框架识别了动态顺式调控元件中调控皮肤分化中具有不同作用的同步基因模块的协同DNA序列规则。大规模并行报告基因分析验证了时间动态和协同顺式调控逻辑。与人类多基因皮肤病相关的变异在这些时间依赖性组合基序规则中富集。这种整合方法展示了表皮分化的组合顺式调控词汇表，并代表了一种通用框架，用于解读动态基因调控的顺式调控代码的组织原理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何定量理解表皮分化过程中顺式调控元件中DNA序列基序词汇表如何动态调控染色质可及性和基因表达？
- 核心机制
- 转录因子协同结合组合基序，产生乘法或超乘法效应，驱动动态染色质可及性和下游基因表达模块。
- 主要证据
- 通过多组学数据（ATAC-seq、ChIP-seq等）鉴定40,103个动态CREs，CNN模型预测染色质可及性，MPRA验证了55/80个基序对的时间动态和43/55的显著活性，以及体内报告基因和组织模型验证。
- 研究意义
- 提供了一个用于解读表皮分化中组合顺式调控代码的通用框架，并有潜力用于精细定位皮肤病相关变异和机制研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定动态CREs和基因表达轨迹
识别在分化过程中表现出显著动态变化的顺式调控元件和基因。
使用ATAC-seq数据鉴定40,103个动态CREs，聚类为15个轨迹；使用PAS-seq鉴定3,609个动态表达基因，聚类为11个轨迹。
深度学习模型构建与解释
学习DNA序列与染色质可及性之间的映射，并识别预测性基序实例及其组合规则。
训练多任务CNN预测1kb序列的ATAC-seq信号，使用迁移学习；通过贡献分数和基序扫描鉴定预测性基序实例，并分析基序对的交互效应。
MPRA验证
验证预测的基序对的时间动态和组合逻辑是否反映在内在调控活性中。
设计包含野生型及组合突变序列的MPRA文库，在分化的0、3、6天测量报告基因表达。
体内和生化验证
验证特定基序规则在组织和细胞中的功能。
对CEBPD-ZNF750和KLF4-ZNF750规则的代表性实例进行荧光素酶和GFP报告基因实验、ChIP-ReChIP、ZNF750敲除和表皮类器官实验。
疾病关联分析
评估组合基序规则是否富集皮肤疾病相关的遗传变异。
使用UK Biobank GWAS数据和LD分数回归分析测试皮肤表型（如银屑病、痤疮等）的遗传力富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
体内效果评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | Life Technologies | 17005-142 |
| 154培养基 | Life Technologies | M-154-500 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP DNA纯化试剂盒 | Zymo Research | D5205 |
| 抗CREB1抗体 | Millipore | 06-863 | |
| 抗ETV5抗体 | Proteintech | 13011-1-AP | |
| 抗KLF4抗体 | Sigma | SAB2701975 | |
| 抗ZNF750抗体 | Sigma | HPA023012 | |
| 抗CEBPD抗体 | Thermo Fisher | PA5-30262 | |
| 免疫荧光 | 抗GFP抗体 | Thermo Fisher | A-11122 |
| 抗丝聚蛋白抗体 | Abcam | 81468 | |
| Duolink原位封片剂含DAPI | Sigma | -- | |
| 显微镜 | 蔡司Axio Observer Z1荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 荧光测量 | Tecan Infinite M1000酶标仪 | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | 原代人角质形成细胞的分离来源、培养条件（Keratinocyte-SFM和Medium 154）、钙浓度（1.2 mM）、诱导时间（6天）、时间点采样（每12小时）。 阅读提示：Methods: Experiments and data processing |
| 多组学测序 | ATAC-seq、ChIP-seq（H3K27ac、H3K4me1、H3K27me3）、PAS-seq、HiChIP的测序深度、抗体、样本量。 阅读提示：Methods: Experiments and data processing; Supplementary Methods |
| 深度学习模型 | 模型架构（Basset CNN）、训练/验证/测试划分（十折交叉验证）、迁移学习策略、超参数。 阅读提示：Methods: Deep learning; Supplementary Methods |
| MPRA设计 | 文库构建（共77,090个序列，每对基序19个基因组序列）、慢病毒转导、分化时间点（0、3、6天）、测序平台。 阅读提示：Methods: MPRA design, Library cloning, cell culture and sequencing |
| 生化验证 | 报告基因构建（pGreenFire）、转导、筛选（嘌呤霉素）、ChIP-ReChIP条件、类器官培养条件。 阅读提示：Methods: Biochemical characterization of combinatorial rules |