在斑马鱼中进行化学筛选
鉴定能够促进β细胞增殖的化合物。
建立了表达LUCCI报告基因的转基因斑马鱼系Tg(ins:NLuc-gmnn)，使用此模型筛选化学库（包含3119种化合物），寻找在基础状态和β细胞再生状态下能增加LUCCI信号的化合物。
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体内筛选鉴定出一种SIK抑制剂通过瞬时UPR诱导β细胞增殖
In vivo screen identifies a SIK inhibitor that induces β cell proliferation through a transient UPR
实验完整度
高包含体外高通量筛选（LUCCI）、斑马鱼体内模型、小鼠及人类胰岛细胞实验、动物体内实验（野生型小鼠）、单细胞RNA-seq、机制验证（Atf6敲低、IRE1抑制剂）等至少两个独立证据层级，并包含明确的功能验证和机制验证。
主要模型
斑马鱼转基因系Tg(ins:NLuc-gmnn) 小鼠原代胰岛细胞（C57BL/6J） 人类胰岛细胞（尸体供体） MIN6小鼠β细胞系
重点核对
斑马鱼β细胞再生模型中HG的浓度（10 μM） 小鼠胰岛细胞培养中HG的处理时间（48小时和96小时） 小鼠原代胰岛细胞中HG的剂量（从5 μM到0.02 μM的范围） 体内小鼠模型中HG的给药剂量（10 mg/kg/天） 人类胰岛细胞中HG的处理浓度（1 μM）
摘要
已知β细胞增殖在发育过程中以及成体某些高血糖条件下会扩增β细胞团，这一过程可能用于糖尿病的β细胞再生。在此，我们通过在斑马鱼中使用基于发光泛素化的细胞周期指示剂（LUCCI）进行新的高通量筛选，鉴定出HG-9-91-01（以下简称HG）是驱动增殖的因素，并在小鼠和人类β细胞中证实了这一效应。HG-9-91-01是一种盐诱导激酶（SIKs）抑制剂，并且Sik1在β细胞中的过表达阻断了HG-9-91-01对β细胞增殖的作用。对小鼠β细胞的单细胞转录组分析表明，HG-9-91-01在细胞周期进入前诱导了一波激活转录因子（ATF）6依赖的未折叠蛋白反应（UPR）。重要的是，UPR波与胰岛素表达的增加无关。进一步的机制研究表明，HG-9-91-01诱导了SIK抑制下游的多种信号效应因子，包括CRTC1、CRTC2、ATF6、IRE1和mTOR，它们整合在一起共同驱动β细胞增殖。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何鉴定能够促进β细胞增殖的化学物质，并阐明其作用机制。
- 核心机制
- HG通过抑制盐诱导激酶（SIKs），触发ATF6和IRE1依赖的瞬时未折叠蛋白反应（UPR），尽管胰岛素表达下调，最终通过整合CRTC1、CRTC2、ATF6、IRE1和mTOR等效应因子，驱动β细胞增殖。
- 主要证据
- 通过斑马鱼体内筛选、微量滴定板上的斑马鱼LUCCI实验、组织切片上的β细胞增殖分析、流式细胞术、单细胞RNA-seq、Western blot、免疫荧光等技术，HG被证实可增加β细胞增殖，并鉴定出其作用机制涉及UPR。
- 研究意义
- 该研究提出了一种新概念，即小分子HG能够在不通过增加胰岛素表达引起ER应激的情况下激活UPR，从而利用UPR扩增β细胞数量，为糖尿病治疗提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在离体小鼠胰岛素瘤细胞中验证增殖效应
验证HG在哺乳动物系统中的促增殖效应。
从小鼠分离胰岛并用Accutase分散，用HG（或对照）处理细胞48小时或96小时，通过Ki67表达和EdU掺入分析评估β细胞增殖。
在小鼠和人类胰岛细胞中证实HG的效应
确认HG在更高级物种中对β细胞增殖的影响。
通过免疫荧光和EdU/BrdU掺入，评估HG对小鼠和人类胰岛细胞中β细胞增殖的影响。
通过单细胞转录组学分析揭示新机制
识别HG处理β细胞后的早期转录特征。
对离体小鼠胰岛分散细胞进行scRNA-seq（Smart-seq2），在HG处理6小时、48小时和96小时后进行细胞聚类和轨迹分析。
验证ATF6和IRE1通路在HG诱导增殖中的作用
验证UPR在HG机制中的必需性。
使用Atf6敲低（通过Ad-Cre转导Atf6 floxed小鼠胰岛）和IRE1抑制剂（4μ8C）处理，评估它们对HG诱导的β细胞增殖的影响。同时，在MIN6细胞中评估了HG对BIP和ATF6-N蛋白水平的影响。
在体内评估HG的效果
在活体环境中评估HG对β细胞增殖及UPR激活的影响。
将含有HG（10 mg/kg/天）或赋形剂的微型渗透泵皮下植入野生型C57BL/6J小鼠，通过BrdU掺入评估β细胞增殖，通过免疫组化检测BIP表达评估UPR激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学筛选 | GloMax 96微孔板发光计 | Promega | GM3000 |
| 细胞培养 | Accutase | Sigma-Aldrich | -- |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| 药物处理 | HG-9-91-01 | MedChemExpress | HY-15776 |
| 利尼伐尼 | Selleckchem | S1003 | |
| 哈尔明碱 | Sigma-Aldrich | 286044 | |
| 伊马替尼 | Selleckchem | S2475 | |
| IRE1抑制剂4μ8C | Sigma-Aldrich | 412512 | |
| AA 147 | Tocris | 6759 | |
| PP 242 | Tocris | 4257 | |
| 4-苯基丁酸 | Sigma-Aldrich | SML0309 | |
| 免疫染色 | 抗胰岛素抗体 | Dako | A0564 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 555成像试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10338 | |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | ab6326 | |
| Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10247 | |
| LSM 710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| ImageXpress Micro XLS宽场系统 | Molecular Devices | -- | |
| Western blot | 抗磷酸化IRE1抗体 | Abcam | ab124945 |
| 抗sXBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 12782 | |
| 抗CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| 抗磷酸化EIF2抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | EMD Millipore | MAB1501 | |
| 抗ATF6抗体 | Proteintech | 24169-1-AP | |
| 抗BIP抗体 | Cell Signaling | 3177 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| RT-qPCR | SuperScript IV VILO试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 11756050 |
| SYBR Green | -- | -- | |
| RealPlex 2 PCR仪 | Eppendorf | -- | |
| RNA-seq | Illumina HiSeq 2000 | Illumina | -- |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | -- | |
| 细胞培养 | MIN6细胞 | AddexBio | C0018008 |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 |
| 蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 | |
| 动物实验 | 微型渗透泵 | Alzet | -- |
| 组织学 | 抗BIP抗体 | Cell Signaling | 3177 |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | 152095 | |
| 抗胰岛素抗体 | Dako | A0564 | |
| 柠檬酸盐缓冲液 | Dako | S236984 | |
| 抗GFP抗体 | Aves Labs | GFP-1020 | |
| 抗dsRed抗体 | Clontech | 632496 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼LUCCI筛选 | 斑马鱼品系、发育阶段、处理浓度、处理时间 阅读提示：Methods: Luminescence ubiquitination-based cell cycle indicator; 图1及图注 |
| 小鼠胰岛细胞离体培养 | 小鼠品系、胰岛分离消化步骤、培养基组分与浓度、处理时间、检测方法 阅读提示：Methods: Mouse islet isolation and cell culture |
| 人类胰岛细胞培养 | 人类胰岛供体信息、分离方法、培养基组成、处理时间 阅读提示：Methods: Human islets |
| 体内小鼠实验 | 小鼠品系、年龄、性别、渗透泵型号、HG给药剂量、治疗时间、BrdU掺入剂量与方式 阅读提示：Methods: In vivo mouse study |
| MIN6细胞实验 | 细胞系来源与代数、培养基组成、HG浓度、处理时间、检测蛋白 阅读提示：Methods: Mouse islet isolation and cell culture; 图8 |
| Atf6敲低实验 | Atf6 floxed小鼠背景、胰岛分散、腺病毒转导（Ad-Cre或Ad-LacZ）的MOI和时间、HG浓度和处理时间 阅读提示：Methods: Adenovirus transduction of mouse islet cells; 图7e |
| Western blot | 细胞裂解液组成、蛋白上样量、凝胶浓度、转膜条件、一抗浓度、二抗浓度、显色底物 阅读提示：Methods: Western blotting |
| scRNA-seq | 细胞消化方法、细胞数量、文库制备协议（Smart-seq2）、测序平台与读长、数据过滤标准（QC指标） 阅读提示：Methods: Single-cell RNA-seq of islet cells; 扩展数据图3 |
| 免疫沉淀 | 转染质粒、转染试剂、处理时间、裂解缓冲液、抗体、洗涤条件 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation; 扩展数据图5b,c |