样本收集与多组学样本制备
为四种空间转录组学平台和参考数据集准备统一处理的肿瘤样本。
从三位分别诊断为COAD、HCC和OV的患者收集未经治疗的肿瘤样本，每种肿瘤组织分为三部分，分别用于FFPE包埋、OCT包埋和单细胞悬液制备。
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跨人类肿瘤的高通量亚细胞空间转录组学平台的系统基准测试
Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors.
实验完整度
高包含三种肿瘤患者样本、四种ST平台、CODEX蛋白参考及scRNA-seq参考，并进行了灵敏度、特异性、扩散、分割、注释等多维度功能验证。
主要模型
结肠腺癌（COAD）患者肿瘤组织 肝细胞癌（HCC）患者肿瘤组织 卵巢癌（OV）患者肿瘤组织 四种高通量空间转录组学平台（Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K、Xenium 5K）
重点核对
三种肿瘤样本各来自一位患者，每种肿瘤组织均分为FFPE、OCT包埋和单细胞悬液三部分 ST数据与匹配的scRNA-seq数据在基因水平上的相关性用于评估基因检测灵敏度 通过组织外8 μm bin的转录本计数和距离评估转录本扩散控制 手动注释的核边界用于评估自动细胞分割准确性 与相邻CODEX蛋白数据的空间一致性用于评估细胞类型注释和空间聚类准确性
摘要
空间转录组学技术的最新进展显著提高了分辨率和通量，凸显了系统基准测试的迫切需求。在此，我们制备了结肠腺癌、肝细胞癌和卵巢癌样本的连续组织切片以进行系统评估。利用这些统一处理的样本，我们在四个具有亚细胞分辨率的高通量平台上生成了空间转录组学数据：Stereo-seq v1.3、Visium HD FFPE、CosMx 6K和Xenium 5K。为建立基准真值数据集，我们使用CODEX在所有平台相邻的组织切片上分析了蛋白质，并对相同样本进行了单细胞RNA测序。借助手动核分割和详细注释，我们系统评估了每个平台在捕获灵敏度、特异性、扩散控制、细胞分割、细胞注释、空间聚类以及与相邻CODEX一致性方面的性能。统一生成和处理的多组学数据集可促进计算方法的开发和生物学发现。该数据集可通过SPATCH访问，这是一个用户友好的可视化与下载网络服务器。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在统一实验条件下，四种具有亚细胞分辨率的高通量空间转录组学平台在技术性能和下游分析能力上表现如何？
- 核心机制
- 不同平台因技术策略（基于测序或基于成像）、基因面板大小、背景控制、细胞分割方法和多通道染色等差异，在转录本捕获灵敏度、特异性、扩散控制、细胞分割和注释准确性等方面表现出各自的优势和局限。
- 主要证据
- 通过对COAD、HCC和OV三种肿瘤的连续切片进行四种ST平台分析，并结合相邻切片的CODEX蛋白分析和匹配的scRNA-seq，从捕获灵敏度、特异性、扩散控制、细胞分割、细胞注释、空间聚类和转录本-蛋白一致性等维度进行系统比较。
- 研究意义
- 该基准测试为根据不同研究目标选择空间转录组学平台提供了实践指导，并生成了统一处理的多组学数据集和SPATCH门户，可促进计算方法开发和生物学发现。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组学数据生成
在四种高通量ST平台上生成亚细胞分辨率的空间转录组数据。
对FFPE切片进行Visium HD FFPE、CosMx 6K和Xenium 5K分析，对OCT包埋的新鲜冷冻切片进行Stereo-seq v1.3分析。
CODEX蛋白参考数据生成
在相邻组织切片上获取高分辨率蛋白空间分布，作为ST数据评估的参考。
在所有ST切片的相邻切片上进行16重CODEX抗体染色和成像。
单细胞RNA测序参考数据生成
提供匹配的单细胞转录组参考数据，用于评估ST数据的基因表达准确性。
对新鲜肿瘤组织解离后的单细胞悬液进行scRNA-seq。
ST平台性能多维度评估
系统比较各平台在技术指标和下游分析中的表现。
利用CODEX和scRNA-seq参考数据，评估捕获灵敏度、特异性、扩散控制、细胞分割、细胞注释、空间聚类以及与CODEX的空间一致性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | MACS®组织保存液 | Miltenyi | 130-100-008 |
| 组织固定 | 10%中性福尔马林固定液 | Solarbio | G2161 |
| OCT包埋 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| Stereo-seq v1.3 | Stereo-seq转录组试剂盒v1.3 | STOmics | 201ST13114 or 211ST13114 |
| VAHTSTM DNA纯化磁珠 | VAZYME | N411-02 | |
| Stereo-seq 16条形码文库制备试剂盒 | STOmics | 101KL160 or 111KL160 | |
| Visium HD FFPE | Visium HD FFPE组织制备手册 | 10x Genomics | CG000684 |
| Visium HD空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics | CG000685 | |
| 探针连接酶 | 10x Genomics | PN-2000425 | |
| Xenium 5K | Xenium FFPE组织原位制备指南 | 10x Genomics | CG000578 |
| Xenium载玻片 | 10x Genomics | PN-3000941 | |
| Xenium FFPE脱蜡和去交联原位实验方案 | 10x Genomics | CG000580 | |
| Xenium Prime原位基因表达（含可选细胞分割染色） | 10x Genomics | CG000760 | |
| Xenium细胞分割染色试剂 | 10x Genomics | PN-1000661 | |
| Xenium Prime 5K人类泛组织与通路面板 | 10x Genomics | PN-1000724 | |
| Xenium分析仪用户指南 | 10x Genomics | CG000584 | |
| Xenium分析仪 | 10x Genomics | PN-1000529 | |
| CosMx 6K | CosMx SMI RNA实验手动载玻片制备指南 | NanoString Technologies | MAN-10184-02 |
| 人类6K Discovery面板（6K-plex RNA） | NanoString Technologies | 121500041 | |
| CosMxTM人类通用细胞分割试剂盒（RNA） | NanoString Technologies | 121500020 | |
| CosMx SMI系统 | -- | cat #101000, S/N: SMI_2307H0124 | |
| 仪器用户手册 | NanoString Technologies | MAN-10161-05 | |
| CODEX | PhenoCycler-Fusion用户指南2.2.0 | Akoya Biosciences | PD-000011 REV M |
| 水化缓冲液 | Akoya Biosciences | P/N 7000017 | |
| 染色缓冲液 | Akoya Biosciences | P/N 7000017 | |
| PhenoCycler-Fusion仪器 | -- | PhenoCycler-Fusion 2.0 | |
| scRNA-seq | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| Chromium单细胞3’ GEM、文库与凝胶珠试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN-1000268 | |
| Chromium单细胞G芯片试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| T100 PCR热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| Qubit荧光定量仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 生物分析仪2100 | Agilent | -- | |
| Stereo-seq v1.3 | Leica CM1950冷冻切片机 | Leica | -- |
| Visium HD FFPE | Fisher Scientific载玻片 | Fisher Scientific | 1255015 |
| CosMx 6K | CIITOTEST载玻片 | CIITOTEST | 188105 |
| CODEX | Fisher Scientific载玻片 | Fisher Scientific | 1255015 |
| Stereo-seq v1.3 | MGI DNBSEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| Visium HD FFPE | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与处理 | 肿瘤类型（COAD、HCC、OV）、患者数量（每种肿瘤一位）、组织处理方式（FFPE、OCT、单细胞悬液） 阅读提示：Methods中Human sample collection and preprocessing小节及Fig. 1a |
| Stereo-seq v1.3数据生成 | 切片厚度（10 μm）、RIN值要求（≥6）、组织透化条件、测序深度 阅读提示：Methods中Stereo-seq v1.3 data generation小节 |
| Visium HD FFPE数据生成 | 切片厚度（5 μm）、探针杂交和连接条件、测序平台 阅读提示：Methods中Visium HD for FFPE data generation小节 |
| Xenium 5K数据生成 | 切片厚度（5 μm）、探针杂交时间（50°C 16-24小时）、连接条件（42°C 30分钟）、扩增条件 阅读提示：Methods中Xenium 5K data generation小节 |
| CosMx 6K数据生成 | 切片厚度（5 μm）、抗原修复条件（100°C 15分钟）、蛋白酶消化条件（40°C 30分钟）、探针孵育过夜 阅读提示：Methods中CosMx 6K data generation小节 |
| CODEX数据生成 | 抗体面板（16-plex）、抗原修复条件（11.6PSI/110°C 20分钟）、抗体孵育时间（室温3小时） 阅读提示：Methods中CODEX data generation小节 |
| scRNA-seq数据生成 | 细胞活力（>85%）、文库构建试剂盒、测序平台 阅读提示：Methods中scRNA-seq data generation小节 |
| 数据分析 | bin大小（8 μm）、ROI选择标准、质量控制阈值、统计方法 阅读提示：Methods中Data preprocessing及各项评估小节 |