UTUC单细胞与单核转录组图谱构建
明确UTUC肿瘤与正常组织的细胞组成及异质性
对新鲜切除的UTUC肿瘤组织与癌旁组织行scRNA-seq和snRNA-seq，合并数据质控后聚类并基于标志基因注释细胞类型
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肿瘤相关成纤维细胞调控尿路上皮癌进展
The tumor-associated fibroblasts regulate urothelial carcinoma progression.
实验完整度
高含scRNA-seq、snRNA-seq、Stereo-seq及120例UTUC等组织芯片多层级证据，并行CellPhoneDB通讯与风险模型验证
主要模型
UTUC肿瘤组织及癌旁组织scRNA-seq/snRNA-seq UTUC组织Stereo-seq空间转录组 含120例UTUC、50例癌旁及25对BUC的MIC组织芯片队列 TCGA-BLCA、GSE13507、IMvigor210公共队列
重点核对
scRNA-seq与snRNA-seq合并质控后保留136042个高质量细胞/核，聚为28个细胞簇、注释7种细胞类型 CAFs再聚类为11个亚群，因Cluster 4以核糖体相关基因为主标志而剔除，最终注释为10个亚群 CellPhoneDB受体-配体分析阈值P-value<0.05且表达均值>1，用于筛选CAF与三类恶性上皮细胞的显著互作 风险模型基于myCAFs1与myCAFs2前30个标志基因，TCGA-BLCA队列随机等分训练集与测试集，训练集经Lasso Cox筛选后构建多因素Cox模型 MIC队列采用Opal 6 Plex试剂盒，COL1A1、FN1、CALM1抗体均按1:100稀释进行多重免疫荧光验证
摘要
肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌相关调控因子调控肿瘤发生、肿瘤细胞增殖和转移；然而，CAFs在上尿路尿路上皮癌（UTUC）发展中的调控作用仍不清楚。本研究利用单细胞RNA测序、单核RNA测序、空间增强分辨率组学测序和UTUC免疫荧光芯片队列，构建了首个CAFs的综合微环境图谱，从而研究CAFs在UTUC进展中的作用。通过层次聚类和UTUC上皮细胞的拷贝数变异评分，我们将肿瘤上皮细胞分为高恶性潜能、中恶性潜能和低恶性潜能三类。我们发现不同CAF亚群与全部三种上皮细胞之间存在明显的相互作用信号，其中高恶性上皮细胞与肌成纤维细胞样CAFs1（myCAFs1）和myCAFs2亚群的通讯信号最为显著，CAFs产生的FN1和COL1A1在该过程中发挥关键作用，提示UTUC的进展可能归因于CAFs对肿瘤细胞的激活。此外，myCAFs1和myCAFs2同时影响膀胱尿路上皮癌（BUC）预后，风险模型在多个队列中显示出良好一致性。因此，本研究构建了UTUC的多组学图谱，并鉴定了与BUC共享的常见预后标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAFs在UTUC进展中发挥何种作用，其亚群特征及与肿瘤细胞的互作关系如何，能否据此建立预后与免疫治疗反应预测模型。
- 核心机制
- myCAFs1与myCAFs2来源的FN1和COL1A1形成物理屏障，阻碍免疫介导的肿瘤细胞杀伤并促进免疫抑制性细胞亚群富集；FN1和COL1A1与CALM1、NOTCH3、MAP1B等风险基因正相关，可能协同驱动肿瘤进展。
- 主要证据
- scRNA-seq、snRNA-seq与Stereo-seq构建UTUC微环境图谱；CellPhoneDB显示高恶性上皮细胞与myCAFs1、myCAFs2通讯最强；MIC队列显示FN1与COL1A1共定位，且FN1、COL1A1、CALM1高表达者5年预后更差；TCGA-BLCA、GSE13507与IMvigor210队列验证风险模型对预后及免疫治疗反应的预测能力。
- 研究意义
- 构建了UTUC多组学图谱，鉴定出与BUC共享的预后标志物，为理解UC基质微环境及制定个体化治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
上皮细胞恶性程度分层
评估UTUC上皮细胞的恶性潜能并分层
以T细胞为对照用InferCNV计算上皮细胞CNV，K-means无监督聚类（n=5）获得CNV评分，结合NMF与层次聚类划分模块并定义HMECs、MMECs、LMECs
CAF亚群鉴定与转录因子分析
解析UTUC中CAFs的亚群构成与分子特征
提取肿瘤组织成纤维细胞再聚类，剔除以核糖体相关基因为主标志的Cluster 4后注释为10个CAF亚群，并行GO注释、Spearman相关分析及pySCENIC转录因子分析
CAF与上皮细胞通讯分析
识别CAF亚群与不同恶性程度上皮细胞之间的关键互作信号
利用CellPhoneDB进行受体-配体对分析，并计算互作最显著细胞亚群间的Spearman相关系数
Stereo-seq空间定位验证
在空间层面验证CAF亚群及FN1、COL1A1、CALM1的分布与共定位
以scRNA-seq和snRNA-seq数据为参考，用SPOTlight对UTUC切片进行细胞类型空间注释，观察FN1、COL1A1、CALM1空间表达及免疫微环境特征
CAF相关风险模型构建与验证
建立基于myCAFs1和myCAFs2的BUC预后与免疫治疗反应预测模型
提取各CAF亚群前30个标志基因在TCGA-BLCA和IMvigor210中计算ssGSEA评分，选取myCAFs1和myCAFs2行单因素Cox回归，TCGA-BLCA随机等分组后训练集行Lasso Cox筛选并构建多因素Cox模型，在GSE13507和IMvigor210中外部验证
MIC队列中FN1、COL1A1与CALM1验证
在UTUC与BUC组织芯片中验证关键基因的表达、共定位及预后价值
对MIC行多重免疫荧光染色，用ImageJ Plot Profile测量黄线处灰度值评估FN1与COL1A1共定位，并行5年生存分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Stereo-seq组织保存 | 组织保存液 | Miltenyi Biotec | -- |
| Stereo-seq组织包埋 | OCT包埋剂 | Sakura | -- |
| Stereo-seq RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| Stereo-seq RNA质控 | 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Stereo-seq文库定量 | Qubit双链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| Stereo-seq PCR扩增 | KAPA HiFi HotStart预混液 | -- | -- |
| Stereo-seq产物纯化 | AMPure XP磁珠 | -- | -- |
| Stereo-seq测序 | MGI DNBSEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| 多重免疫荧光 | Opal 6色全切片成像检测试剂盒 | PerkinElmer | NEL871001KT |
| COL1A1抗体 | Arigo | ARG21965 | |
| FN1抗体 | Abcam | ab32419 | |
| CALM1抗体 | Thermo Fisher | MA3-917 | |
| Opal抗鼠+兔HRP及抗山羊HRP二抗 | Akoya Biosciences | -- | |
| 多重免疫荧光封片 | ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UTUC组织样本采集 | 癌旁组织距肿瘤边缘至少3 cm；患者术前无放化疗；样本来源与伦理批号KHLL2022-KY004 阅读提示：Materials and methods 中 snRNA-seq and scRNA-seq cohorts 小节 |
| 单细胞/单核测序质控与聚类 | 每细胞/核基因数300–5000、保留25%线粒体UMI、基因至少在3个细胞表达；分辨率0.5、前15个主成分 阅读提示：Materials and methods 中 Processing of the snRNA-seq and scRNA-seq data 小节 |
| 上皮细胞恶性分层 | K-means聚类数n=5；NMF模块划分依据与top 30基因 阅读提示：Materials and methods 中 CNV and NMF analyses in malignant epithelial cells 小节及Figure 2 |
| CAF亚群鉴定 | CAFs初聚类亚群数、剔除Cluster 4的依据、最终10个亚群命名 阅读提示：Results 中 CAF subclusters of UTUC 小节及Figure 3 |
| 细胞通讯分析 | CellPhoneDB版本3.1.0、默认参数、P-value<0.05且表达>1的筛选阈值 阅读提示：Materials and methods 中 Cell–cell communication 小节及Figure 4 |
| Stereo-seq空间验证 | 组织切片厚度、RIN≥7、SPOTlight版本1.0.1及myCAFs合并方式 阅读提示：Materials and methods 中 Stereo-seq cohort 与 Processing of Stereo-seq data 小节及Supplementary Figure S12 |
| 风险模型构建 | TCGA-BLCA随机等分方式、训练集Lasso Cox筛选流程、风险评分公式与中位数分组 阅读提示：Materials and methods 中 Building CAF-related risk model 与 Risk score 小节及Figure 5 |
| MIC多重免疫荧光验证 | 抗体稀释比1:100及货号、Opal 6 Plex试剂盒、5年生存分析终点 阅读提示：Materials and methods 中 Multiplex immunofluorescence on tissue microarrays 小节及Figure 6 |