慢性应激诱导恐惧行为及外周炎症反应
确定慢性束缚应激对恐惧行为和外周细胞因子的影响。
小鼠接受7、12或18天束缚应激，随后进行情境恐惧条件化和EPM测试，并检测血浆皮质酮和细胞因子。
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致幻剂调控支配恐惧的神经免疫相互作用
Psychedelic control of neuroimmune interactions governing fear.
实验完整度
高包含小鼠行为学、scRNA-seq、空间转录组、条件敲低、单核细胞过继转移与清除、体外共培养及人脑样本验证
主要模型
C57Bl/6J小鼠慢性束缚应激模型 Aldh1l1tdTomato/+小鼠杏仁核星形胶质细胞 原代星形胶质细胞-神经元共培养 MDD患者与健康对照杏仁核组织
重点核对
慢性束缚应激持续时间：7天或18天，每日6小时 杏仁核星形胶质细胞Egfr条件性敲低（AAV-GfaABC1D-saCas9-sgEgfr） 神经元Nr2f2条件性敲低（AAV-hSyn-saCas9-sgNr2f2） 致幻剂剂量：1 mg/kg psilocybin或10 mg/kg MDMA racemate，腹腔注射 脑膜单核细胞清除：i.c.m.注射抗CCR2抗体或Ccr2DTR/+小鼠白喉毒素处理
摘要
神经免疫相互作用——免疫细胞与脑细胞之间传递的信号——调控组织生理的许多方面，包括对心理应激的反应，而心理应激可使人易患神经精神疾病。然而，影响复杂行为的造血细胞与脑驻留细胞之间的相互作用仍知之甚少。本文中，我们结合基因组学和行为学筛选，证明杏仁核星形胶质细胞通过表皮生长因子受体（EGFR）限制应激诱导的恐惧行为。机制上，杏仁核星形胶质细胞中的EGFR表达抑制一条应激诱导的促炎信号转导级联，该级联通过杏仁核神经元中的孤儿核受体NR2F2促进神经元-胶质细胞交互和应激诱导的恐惧行为。反过来，EGFR信号和恐惧行为的降低与慢性应激期间脑膜单核细胞的募集相关。这组神经免疫相互作用可通过给予致幻剂进行靶向治疗，致幻剂逆转了脑膜中单核细胞的积累以及恐惧行为。结合临床样本中的验证，这些数据提示致幻剂可用于靶向与神经精神疾病以及可能与其他炎症性疾病相关的神经免疫相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 慢性心理应激下，杏仁核星形胶质细胞与神经元及外周免疫细胞之间的相互作用如何调控恐惧行为，以及该过程是否可被致幻剂靶向。
- 核心机制
- 杏仁核星形胶质细胞EGFR信号抑制应激诱导的促炎级联；EGFR功能缺失伴随IL-1β和皮质酮作用下星形胶质细胞Ptprs表达升高，进而通过神经元SLITRK2上调神经元NR2F2转录程序，促进应激诱导的恐惧行为；慢性应激还招募脑膜炎性单核细胞，致幻剂可逆转该募集及恐惧行为。
- 主要证据
- 小鼠慢性束缚应激结合恐惧条件化与EPM行为学、杏仁核星形胶质细胞和神经元的条件性基因敲低、scRNA-seq、空间转录组Stereo-seq、脑膜单核细胞过继转移与清除、原代细胞共培养，以及MDD患者杏仁核snRNA-seq和免疫染色验证。
- 研究意义
- 提示致幻剂可靶向与神经精神疾病相关的神经免疫相互作用，并可能用于其他炎症性疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
杏仁核星形胶质细胞单细胞转录组分析
鉴定慢性应激下杏仁核星形胶质细胞亚群及其信号通路变化。
对Aldh1l1tdTomato/+小鼠杏仁核tdTomato+细胞进行scRNA-seq（Drop-seq），分析应激与对照条件下的细胞簇和通路。
星形胶质细胞Egfr条件性敲低的行为学验证
验证杏仁核星形胶质细胞Egfr在应激诱导恐惧行为中的作用。
通过AAV-GfaABC1D-saCas9-sgEgfr在杏仁核星形胶质细胞中敲低Egfr，以sgRosa26为对照，7天束缚应激后进行恐惧行为测试和RNA-seq。
星形胶质细胞-神经元交互及Nr2f2功能验证
验证星形胶质细胞Ptprs与神经元Slitrk2/Nr2f2通路在恐惧行为中的作用。
在原代星形胶质细胞-神经元共培养中进行细胞类型特异性敲低，检测Nr2f2等转录因子表达；在体内敲低神经元Nr2f2、Cebpg或Ets1，进行7天束缚应激和恐惧行为测试，并结合RNA-seq和ATAC-seq。
脑膜单核细胞在慢性应激恐惧行为中的作用
验证脑膜炎性单核细胞对慢性应激诱导恐惧行为的调控。
通过过继转移单核细胞、i.c.m.注射抗CCR2抗体清除单核细胞、Ccr2DTR/+小鼠白喉毒素清除单核细胞，结合FACS、行为学和RNA-seq分析。
致幻剂对神经免疫相互作用及恐惧行为的调控
验证psilocybin和MDMA对脑膜单核细胞募集及恐惧行为的影响。
18天束缚应激小鼠腹腔注射psilocybin或MDMA racemate，FACS分析脑膜免疫细胞，ELISA检测脑膜外植体细胞因子，并进行恐惧消退测试和血管荧光成像。
人源样本验证
验证小鼠发现的EGFR-PTPRS-NR2F2轴在人类MDD中的相关性。
原代人星形胶质细胞和单核细胞体外刺激，MDD患者与健康对照杏仁核snRNA-seq、qPCR和免疫染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 白喉毒素 | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| 行为学 | 香蕉提取物 | Shank’s Extracts | S90159 |
| 柠檬提取物 | Shank’s Extracts | S90066 | |
| 细胞培养 | 木瓜蛋白酶悬液 | Worthington | LS003126 |
| DNA酶 | Worthington | LS002007 | |
| 卵类黏蛋白胰蛋白酶抑制剂 | Worthington | LS003086 | |
| 流式分析 | Percoll分离液 | GE Healthcare Biosciences | 17-5445-01 |
| FACS Aria IIu流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 单细胞测序 | Drop-seq微流控装置 | -- | -- |
| 条形码磁珠 | Fisher Scientific | NC0927472 | |
| Maxima H-minus逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0753 | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer高灵敏度DNA芯片 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Nextera转座DNA缓冲液 | Illumina | FC-131-1096 | |
| 文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| 血浆检测 | 人昼夜/应激2重定制检测 | MilliporeSigma | HNCSMAG-35K |
| 小鼠高灵敏度18重发现检测 | MilliporeSigma | FCYTMAG20KPX19BK | |
| AAV生产 | pAAV-FLEX-SaCas9-U6-sgRNA质粒 | Addgene | 124844 |
| pAAV2/5包装质粒 | Addgene | 104964 | |
| pAdDeltaF6辅助质粒 | Addgene | 112867 | |
| AAVpro 293T细胞 | Takara | 632273 | |
| PEI MAX转染试剂 | Polysciences | 49553-93-7 | |
| Amicon Ultra-15离心过滤装置 | EMD Millipore | UFC910024 | |
| AAV滴度测定 | qPCR AAV滴度试剂盒 | Applied Biological Materials | G931 |
| 立体定位注射 | Hamilton注射器 | Sigma-Aldrich | 20787 |
| 免疫染色 | 兔抗EGFR抗体(D38B1) | Cell Signaling | 4267 |
| 兔抗PTPRS抗体 | Proteintech | 13008-1-AP | |
| 兔抗HOMER1抗体 | Synaptic systems | 160002 | |
| 豚鼠抗VGLUT2抗体 | Sigma | AB2251-I | |
| 兔抗IL-1R1抗体 | Abcam | ab106278 | |
| 兔抗IBA1抗体 | Abcam | ab178846 | |
| 小鼠抗S100β抗体 | Millipore Sigma | S2532 | |
| 驴抗兔IgG(H+L)高交叉吸附Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| 星形胶质细胞分离 | ACSA-2微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-097-679 |
| 神经元分离 | 成年神经元分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-126-602 |
| RNA提取 | PicoPure提取缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 |
| 原代星形胶质细胞培养 | DMEM/F12 + GlutaMAX培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10565018 |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma Aldrich | P4707 | |
| 体外刺激 | 肿瘤坏死因子 | R&D Systems | 410-MT-010 |
| 白细胞介素-1β | R&D Systems | 401-ML-005 | |
| 白细胞介素-12 | Pepro-Tech | 210-12 | |
| 皮质酮 | Millipore Sigma | 27840 | |
| 裸盖菇素 | NIDA Drug Supply Program | -- | |
| MDL 100907 | Tocris Biotechne | 4173 | |
| 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| qPCR | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Life Technologies | 4368813 |
| TaqMan快速通用PCR预混液 | Life Technologies | 4367846 | |
| ATAC-seq | NEBNext高保真2×PCR预混液 | New England Biolabs | M0541S |
| MiniElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| Stereo-seq | Stereo-seq透化芯片 | STOmics | 210CP118 |
| Stereo-seq转录组芯片 | STOmics | 210CT114 | |
| 文库构建试剂盒 | STOmics | 111KL114 | |
| 脑膜细胞分离 | 胶原酶P | Sigma-Aldrich | 11213865001 |
| 中性蛋白酶 | Worthington | LS02104 | |
| DNA酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| FACS | BUV661抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 612975 |
| BV570抗小鼠Ly6C抗体 | BioLegend | 128029 | |
| FITC抗小鼠CD192(CCR2)抗体 | BioLegend | 150608 | |
| 单核细胞分离 | 单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-629 |
| i.c.m.注射 | 抗CCR2抗体 | R&D Systems | MAB55381 |
| 同型对照抗体 | R&D Systems | MAB0061 | |
| 小鼠IL-1β | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-生物素试剂盒 | Thermo Fisher | A39256 | |
| Pierce C18离心柱，7K MWCO | Thermo Fisher | 89870 | |
| 药物处理 | 硝苯地平 | Sigma-Aldrich | N7634 |
| 活体成像 | IVISense血管750荧光染料 | Revvity | NEV10011EX |
| 人原代星形胶质细胞培养 | 人星形胶质细胞 | ScienCell | 1800 |
| 人原代单核细胞培养 | 人原代单核细胞 | iQ Biosciences | IQB-Hu1-M10 |
| snRNA-seq | 10× Chromium细胞核分离试剂盒 | 10× Genomics | PN-1000494 |
| 10x Genomics试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000283 | |
| 人组织免疫染色 | 小鼠抗EGFR抗体 | Abcam | ab30 |
| 兔抗GFAP抗体 | Abcam | ab68428 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 慢性束缚应激 | 应激持续时间（7、12或18天）、每日6小时、开始时间（9:00–10:00）、小鼠年龄（2–3月龄） 阅读提示：Methods中“Restraint stress”小节 |
| 杏仁核星形胶质细胞Egfr敲低 | AAV血清型（AAV2/5）、启动子（GfaABC1D）、sgRNA序列、注射坐标（BLA：±3.3 mm lateral, −1.6 mm posterior, −4.5 mm ventral）、注射速率（75 nl/min）和体积 阅读提示：Methods中“Cloning of AAV vectors”“AAV production”和“Stereotaxic injections”小节 |
| 神经元Nr2f2敲低 | AAV启动子（hSyn）、sgRNA序列、行为学时间点（7天应激后） 阅读提示：Methods中“Cloning of AAV vectors”和“Stereotaxic injections”小节，以及Fig. 2d,e图注 |
| 致幻剂给药 | psilocybin 1 mg/kg或MDMA racemate 10 mg/kg、腹腔注射、给药时间（末次应激后24小时或恐惧消退前2小时） 阅读提示：Methods中“Administration of psychedelics”小节及图注 |
| 脑膜单核细胞清除 | 抗CCR2抗体剂量（24 μg，i.c.m.）或Ccr2DTR/+小鼠白喉毒素剂量（5 μg/kg，i.p.）及给药频率 阅读提示：Methods中“Injections by i.c.m”和“Mice”小节 |
| 人源样本snRNA-seq | MDD患者与对照匹配（性别、年龄、种族）、样本量（每组6例）、细胞核分离和建库试剂盒 阅读提示：Methods中“10x Genomics snRNA-seq”小节 |