肺部单细胞时空分析揭示Slamf9+巨噬细胞参与病毒清除和炎症消退

Single-cell spatiotemporal analysis of the lungs reveals Slamf9+ macrophages involved in viral clearance and inflammation resolution.

作者信息Boyi Cong, Xuan Dong, Zongheng Yang, Pin Yu, Yangyang Chai, Jiaqi Liu, Meihan Zhang, Yupeng Zang, Jingmin Kang, Yu Feng, Yi Liu, Weimin Feng, Dehe Wang, Wei Deng, Fengdi Li, Zhiqi Song, Ziqiao Wang, Xiaosu Chen, Hua Qin, Qinyi Yu, Zhiqing Li, Shuxun Liu, Xun Xu, Nanshan Zhong, Xianwen Ren, Chuan Qin, Longqi Liu, Jian Wang, Xuetao Cao

PMID39414783

期刊Cell Discov

发布时间2024-10-16

DOI10.1038/s41421-024-00734-4

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实验完整度

高

包含仓鼠SARS-CoV-2感染模型的单细胞和空间转录组分析，hACE2小鼠验证，以及公共人尸检数据验证，涉及多种细胞类型和功能机制。

主要模型

叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染模型 hACE2小鼠SARS-CoV-2感染模型 C57BL/6J小鼠IAV感染模型 COVID-19患者尸检肺组织单细胞RNA-seq数据

重点核对

叙利亚仓鼠感染SARS-CoV-2剂量为10^5 TCID50/mL，每只0.1 mL，鼻内接种 hACE2小鼠感染SARS-CoV-2剂量为10^5 TCID50，鼻内接种 C57BL/6J小鼠IAV感染剂量为3×10^7 PFU，鼻内感染仓鼠肺组织在感染后2、5、7、14天收集，每个时间点n=5 scRNA-seq数据分析使用Seurat等软件，细胞聚类和注释方法

摘要

肺部在感染后如何实现免疫稳态尚不完全清楚。在此，我们分析了叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染模型中肺部在2周自然恢复过程中的时空变化。我们发现SARS-CoV-2感染多种细胞类型并在早期导致大量细胞死亡，包括肺泡巨噬细胞。我们鉴定出一组单核细胞来源的Slamf9+巨噬细胞，它们在SARS-CoV-2感染后被诱导产生，并对SARS-CoV-2造成的损伤具有抵抗性。Slamf9+巨噬细胞包含SARS-CoV-2，招募并与Isg12+Cst7+中性粒细胞相互作用以清除病毒。病毒清除后，Slamf9+巨噬细胞分化为Trem2+和Fbp1+巨噬细胞，在晚期促进炎症消退，并最终补充肺泡巨噬细胞。这些发现在一个SARS-CoV-2感染的hACE2小鼠模型中得到验证，并在公开的人体尸检单细胞RNA-seq数据中得到证实，证明了Slamf9+巨噬细胞及其与中性粒细胞协同在损伤后组织修复和炎症消退中的潜在作用。

建立SARS-CoV-2感染模型

模拟SARS-CoV-2感染及自然恢复过程

叙利亚仓鼠鼻内接种SARS-CoV-2，收集感染后不同时间点的肺组织；hACE2小鼠鼻内接种SARS-CoV-2；C57BL/6J小鼠鼻内感染IAV。

单细胞和空间转录组测序

获得肺部细胞和分子时空图谱

对感染和对照仓鼠肺组织进行scRNA-seq和Stereo-seq，构建细胞亚群图谱，分析病毒RNA阳性细胞和细胞亚群动态。

鉴定Slamf9+巨噬细胞及其特性

确认Slamf9+巨噬细胞在感染后的诱导和功能

通过scRNA-seq和Stereo-seq数据分析Slamf9+巨噬细胞的时空分布、病毒RNA阳性率、基因表达特征；通过免疫荧光和RNAscope验证其存在；通过CellChat分析其与中性粒细胞的相互作用。

验证Slamf9+巨噬细胞对病毒的清除功能

证明Slamf9+巨噬细胞具有清除病毒的能力

在C57BL/6J小鼠IAV感染模型中，分选SLAMF9hi和SLAMF9lo巨噬细胞，检测病毒载量和Ifnb1表达；利用CellChat分析Slamf9+巨噬细胞与中性粒细胞的配体-受体相互作用。

鉴定Isg12+Cst7+中性粒细胞及其与Slamf9+巨噬细胞的协同作用

明确中性粒细胞亚群在病毒清除中的作用

通过scRNA-seq鉴定中性粒细胞亚群，分析Isg12+Cst7+中性粒细胞的时空分布和基因表达；通过Stereo-seq分析其与病毒基因的空间相关性；通过RNA velocity分析其来源。

追踪Slamf9+巨噬细胞的分化命运

确定病毒清除后Slamf9+巨噬细胞的分化方向

使用CellRank分析单核/巨噬细胞在d7到d14的分化轨迹；通过RNA velocity和Monocle2拟时序分析验证；通过免疫荧光和RNAscope验证Trem2+和Fbp1+巨噬细胞的存在。

验证Trem2+和Fbp1+巨噬细胞在炎症消退和肺泡巨噬细胞补充中的作用

确认晚期巨噬细胞亚群的功能

分析Trem2+和Fbp1+巨噬细胞在d14的富集情况；通过Stereo-seq分析其与肺泡巨噬细胞的空间共定位；通过免疫荧光验证其存在；利用公共COVID-19患者尸检scRNA-seq数据验证这些细胞亚群在人类中的存在。

实验环节	名称	品牌	货号
病毒扩增	Dulbecco改良Eagle培养基	Invitrogen	--
胎牛血清	Gibco	--
原位RNA杂交	RNAscope多重荧光检测试剂盒v2	Bio-Techne	323100
含DAPI水溶性封片剂	Abcam	ab104139
免疫荧光染色	10%福尔马林缓冲液	Sigma-Aldrich	HT501128
PANO免疫组化试剂盒	Panovue	10004100100
抗CD68多克隆抗体	Proteintech	28058-1-AP
TREM2多克隆抗体	Proteintech	13483-1-AP
FBP1多克隆抗体	Proteintech	12842-1-AP
骨桥蛋白多克隆抗体	Proteintech	22952-1-AP
SLAMF9多克隆抗体	LMAI BIO	LM-2205R
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚	Sigma-Aldrich	--
肺巨噬细胞分选	I型胶原酶	Gibco	17018029
IV型胶原酶	Gibco	17104019
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
红细胞裂解液	Solabio	R1010
CD16/32抗体	Biolegend	101302
Zombie活性染料	Biolegend	423113
定量RT-PCR	RNAfast2000试剂盒	Fastagen Biotech	220011
ReverTra Ace qPCR RT预混液	TOYOBO	FSQ-201
SYBR Green实时PCR预混液	TOYOBO	QPK-201
scRNA-seq文库构建	DNBelab C系列单细胞文库制备试剂盒	MGI	1000021082
Qubit™ ssDNA检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q10212

实验环节

名称

品牌

货号

病毒扩增

Dulbecco改良Eagle培养基

Invitrogen

胎牛血清

Gibco

原位RNA杂交

RNAscope多重荧光检测试剂盒v2

Bio-Techne

323100

含DAPI水溶性封片剂

Abcam

ab104139

免疫荧光染色

10%福尔马林缓冲液

Sigma-Aldrich

HT501128

PANO免疫组化试剂盒

Panovue

10004100100

抗CD68多克隆抗体

Proteintech

28058-1-AP

TREM2多克隆抗体

Proteintech

13483-1-AP

FBP1多克隆抗体

Proteintech

12842-1-AP

骨桥蛋白多克隆抗体

Proteintech

22952-1-AP

SLAMF9多克隆抗体

LMAI BIO

LM-2205R

4’,6-二脒基-2-苯基吲哚

Sigma-Aldrich

肺巨噬细胞分选

I型胶原酶

Gibco

17018029

IV型胶原酶

Gibco

17104019

DNase I

Sigma-Aldrich

DN25

红细胞裂解液

Solabio

R1010

CD16/32抗体

Biolegend

101302

Zombie活性染料

Biolegend

423113

定量RT-PCR

RNAfast2000试剂盒

Fastagen Biotech

220011

ReverTra Ace qPCR RT预混液

TOYOBO

FSQ-201

SYBR Green实时PCR预混液

TOYOBO

QPK-201

scRNA-seq文库构建

DNBelab C系列单细胞文库制备试剂盒

MGI

1000021082

Qubit™ ssDNA检测试剂盒

Thermo Fisher Scientific

Q10212

环节	核对要点
动物感染模型	仓鼠品系、周龄、性别、接种剂量（10^5 TCID50/mL，0.1 mL/只）、接种途径（鼻内）、对照组（PBS）、样本收集时间点（2、5、7、14天）及样本量（n=5）阅读提示：Materials and methods中Experimental hamsters小节
hACE2小鼠感染模型	小鼠周龄、性别、接种剂量（10^5 TCID50）、接种途径（鼻内）、对照组（PBS）、观察时间点阅读提示：Materials and methods中Experimental mice小节
scRNA-seq和Stereo-seq	组织消化条件（胶原酶I/IV浓度、DNase I浓度、消化时间）、细胞悬液浓度、文库构建试剂盒、测序平台、数据分析参数（如聚类分辨率、过滤标准）阅读提示：Materials and methods中Single-cell suspension preparation、Library construction and sequencing、scRNA-seq data processing及Stereo-seq相关小节
免疫荧光和RNAscope	抗体稀释比例、抗原修复方法、探针信息、成像设备阅读提示：Materials and methods中Multiplex immunofluorescence staining和In situ RNA hybridization小节
流式分选	抗体克隆号、分选设备、设门策略阅读提示：Materials and methods中Sorting for lung macrophages小节
公共数据验证	人尸检scRNA-seq数据来源（GSE），细胞亚群定义基因集阅读提示：Materials and methods中Cell subpopulation similarity analysis between Syrian hamsters and COVID-19 patients小节

环节

核对要点

动物感染模型

仓鼠品系、周龄、性别、接种剂量（10^5 TCID50/mL，0.1 mL/只）、接种途径（鼻内）、对照组（PBS）、样本收集时间点（2、5、7、14天）及样本量（n=5）

阅读提示：Materials and methods中Experimental hamsters小节

hACE2小鼠感染模型

小鼠周龄、性别、接种剂量（10^5 TCID50）、接种途径（鼻内）、对照组（PBS）、观察时间点

阅读提示：Materials and methods中Experimental mice小节

scRNA-seq和Stereo-seq

组织消化条件（胶原酶I/IV浓度、DNase I浓度、消化时间）、细胞悬液浓度、文库构建试剂盒、测序平台、数据分析参数（如聚类分辨率、过滤标准）

阅读提示：Materials and methods中Single-cell suspension preparation、Library construction and sequencing、scRNA-seq data processing及Stereo-seq相关小节

免疫荧光和RNAscope

抗体稀释比例、抗原修复方法、探针信息、成像设备

阅读提示：Materials and methods中Multiplex immunofluorescence staining和In situ RNA hybridization小节

流式分选

抗体克隆号、分选设备、设门策略

阅读提示：Materials and methods中Sorting for lung macrophages小节

公共数据验证

人尸检scRNA-seq数据来源（GSE），细胞亚群定义基因集

阅读提示：Materials and methods中Cell subpopulation similarity analysis between Syrian hamsters and COVID-19 patients小节

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