多海拔人群与小鼠单细胞图谱构建
建立不同海拔人群和小鼠的免疫细胞图谱，比较跨物种细胞组成。
整合4个人类队列和2个小鼠模型的118个scRNA-seq样本，进行质控、批次校正、聚类和细胞类型注释。
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高海拔介导的免疫重塑加速衰老
High altitude-mediated immune remodeling accelerates aging.
实验完整度
高含多海拔人群PBMC scRNA-seq、多器官小鼠模型scRNA-seq、Stereo-seq空间转录组及免疫荧光、流式、RT-qPCR等验证
主要模型
高海拔人群PBMC队列（拉萨3656 m、推瓦村5070 m） 低海拔人群PBMC队列（广州、上海） 模拟5000 m缺氧小鼠多器官模型 AC16心肌细胞缺氧模型
重点核对
人群队列样本量：GZ n=17、SH n=17、LS n=20、TWC n=9 小鼠队列：LAM n=30（300 m）、HAM n=25（5000 m模拟，13% O2） 小鼠年龄分组：年轻2-3月、中年10-11月、老年18-19月，仅雄性C57BL/6J AC16细胞以800 μM CoCl2·6H2O处理24小时建立缺氧模型 Stereo-seq样本RIN≥6，10 μm切片，MGI DNBSEQ-T7测序
摘要
高海拔相关的病理生理过程可能潜在地加速衰老轨迹，但证据仍然有限。我们呈现了居住在青藏高原海拔3656米（拉萨）和5070米（推瓦村）人群的免疫景观特征，并辅以模拟5000米缺氧条件下小鼠的多器官单细胞RNA测序和空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）。比较分析显示，相对于低海拔人群队列，高海拔人群（HAP）队列中中性粒细胞比例显著升高。值得注意的是，包括耗竭T细胞、年龄相关B细胞和高衰老评分免疫细胞在内的衰老相关免疫细胞（AICs）在HAP队列中显著富集，这一模式在小鼠模型中保守。Stereo-seq分析进一步鉴定出AICs与衰老相关肠上皮细胞之间协调的生态位相互作用，提示肠道衰老轨迹加速。我们的工作建立了高海拔免疫重塑的多组学框架，同时为高海拔相关病理生理过程提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 慢性高海拔暴露是否以及如何影响人类免疫衰老和衰老相关变化，尤其是5000米以上极端海拔人群的免疫景观。
- 核心机制
- 高海拔低氧环境促进中性粒细胞扩增及衰老相关免疫细胞（耗竭T细胞、年龄相关B细胞、Treg、记忆T/B细胞等）富集，伴随慢性炎症、干扰素信号、氧化应激和NF-κB通路激活，形成促衰老转录程序，并涉及AICs与衰老相关肠上皮细胞的生态位相互作用。
- 主要证据
- 多海拔人群PBMC scRNA-seq显示HAP队列中性粒细胞比例升高及AICs富集；模拟5000米缺氧小鼠多器官scRNA-seq和Stereo-seq显示保守的免疫重塑及肠道空间共定位；流式细胞术、免疫荧光、免疫组化和RT-qPCR验证中性粒细胞浸润及IFITM1/SOD2表达。
- 研究意义
- 建立了极端海拔人群的高分辨率细胞图谱和高海拔免疫重塑的多组学框架，为高海拔相关衰老及病理过程提供机制见解和资源，并为高原医学及 altitude 相关病理的预防/治疗策略提供理论框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高海拔中性粒细胞扩增与衰老表型分析
验证高海拔暴露是否促进中性粒细胞数量增加及衰老相关转录程序。
对中粒细胞进行亚聚类，比较LS与TWC及LAM与HAM的差异基因、GO富集、Ro/e富集、衰老基因集AUC评分和CytoTRACE分化轨迹。
小鼠多器官高海拔暴露验证
在模拟5000米缺氧小鼠中验证高海拔免疫重塑的多器官保守性和异质性。
对小鼠血液、肺、肝、回肠和结肠进行scRNA-seq，比较LAM与HAM的免疫细胞组成和通路变化。
空间转录组分析免疫-上皮生态位
探究衰老相关免疫细胞与肠道上皮分泌细胞的空间共定位。
对小鼠回肠和结肠进行Stereo-seq，结合scRNA-seq注释进行spot评分，分析mNfkbia+S100+Neu、mIfitm6+S100+Neu、mTreg、mABC与mGoblet_cell、mTuft_cell的空间共定位。
体外与体内实验验证高海拔相关损伤
验证高海拔环境诱导的氧化应激、组织损伤和中性粒细胞变化。
AC16心肌细胞CoCl2缺氧模型检测心肌损伤标志物、SOD、MDA和凋亡；小鼠PBMC流式检测中性粒细胞比例；小鼠心、肺组织免疫组化和RT-qPCR检测凋亡和线粒体功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | ProOx-101C程序化低氧舱 | -- | -- |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3′试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Stereo-seq | MGI DNBSEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Qubit单链DNA染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 多重免疫荧光 | Opal 6色全切片成像检测试剂盒 | PerkinElmer | NEL871001KT |
| p21抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-31479 | |
| Ifitm1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-27495 | |
| Ly6G抗体 | Abcam | ab25377 | |
| Sod2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-133134 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式分析 | CD45-PECy7抗体 | BD Pharmingen | 552848 |
| CD11b-FITC抗体 | BD Pharmingen | 557396 | |
| Ly6G-PE抗体 | BD Pharmingen | 551461 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| 细胞培养 | DMEM-H完全培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| SOD和MDA检测 | SOD和MDA检测试剂盒 | Bioswamp Biotech | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FastKing cDNA第一链合成试剂盒 | Tiangen | -- | |
| SYBR Green预混试剂盒 | Tiangen | -- | |
| LDH和AST检测 | LDH和AST检测试剂盒 | JianCheng | -- |
| CK-MB检测 | CK-MB酶联免疫吸附试剂盒 | Fein Biology | -- |
| PBMC分离 | Ficoll分离液 | -- | -- |
| 细胞冻存 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人群队列样本采集 | 各海拔队列样本量、纳入/排除标准、民族构成和年龄分组 阅读提示：Materials and Methods中Sample source and ethical statement及table S1、S2 |
| 小鼠高海拔模拟 | 低氧舱型号、O2浓度13%、压力0.54-0.44 bar、模拟海拔5000 m、年龄分组和性别 阅读提示：Materials and Methods中Animal experiments |
| AC16缺氧细胞模型 | CoCl2·6H2O浓度800 μM、处理时间24小时、细胞汇合度80-90%、对照条件 阅读提示：Materials and Methods中AC16 hypoxic cell model |
| scRNA-seq建库与质控 | 10x Genomics v3试剂盒、细胞浓度700-1200 cells/μl、活力≥85%、质控阈值UMIs>1000、percent.mt<10 阅读提示：Materials and Methods中scRNA-seq和Processing of scRNA-seq data |
| Stereo-seq空间转录组 | 切片厚度10 μm、RIN≥6、芯片尺寸1 cm×1 cm、测序平台MGI DNBSEQ-T7、读长设置 阅读提示：Materials and Methods中Stereo-seq |
| 流式细胞术中性粒细胞检测 | 抗体克隆和货号、染色温度4°C、染色时间40分钟、7-AAD死细胞染色20分钟 阅读提示：Materials and Methods中Flow cytometry |
| 多重免疫荧光 | 抗体稀释比例1:100、抗原修复条件、Opal试剂盒货号NEL871001KT 阅读提示：Materials and Methods中Multiplex immunofluorescence |