早期LUAD单细胞转录组图谱构建
定义早期LUAD的细胞组成和肿瘤细胞状态
对12例早期LUAD（6例MIA，6例IA）新鲜肿瘤组织进行scRNA-seq，质控后保留103,375个细胞，无监督聚类和标记基因注释主要细胞类型；使用inferCNV鉴定恶性细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
上皮可塑性塑造早期肺癌的瘤内异质性和细胞谱系
Epithelial plasticity shapes intratumoral heterogeneity and cell lineages in early-stage lung cancer.
实验完整度
高包含患者样本scRNA-seq和空间转录组、细胞系功能实验、小鼠移植瘤模型及CUT&Tag/RNA-seq机制验证
主要模型
早期肺腺癌患者肿瘤组织（MIA和IA） A549和NCI-H1437肺腺癌细胞系 A549细胞皮下移植瘤裸鼠模型
重点核对
患者样本：14例早期LUAD（6例MIA，6例IA用于scRNA-seq；另2例用于空间转录组），均未接受过新辅助化疗、放疗或免疫治疗 细胞系：A549和NCI-H1437，通过慢病毒介导KLF4或JDP2过表达，设置Flag对照 动物实验：A549细胞（2×10^6）皮下注射6周龄雌性BALB/c裸鼠，肿瘤生长4-5周，每3天测量 CUT&Tag：使用anti-Flag抗体在Flag-KLF4过表达A549细胞中检测KLF4结合位点 生存分析：TCGA LUAD队列（n=443）和GSE72094队列（n=321），按基因签名评分四分位分组
摘要
瘤内异质性（ITH）主要在局部晚期或转移性癌症中被研究；然而，对早期癌症中ITH的了解要少得多，且ITH的起源也知之甚少。通过对早期磨玻璃样（GGO）肺腺癌（LUAD）的单细胞和空间转录组学分析（14名患者；103,375个细胞），我们系统地定义了肿瘤状态，并证明早期LUAD中存在普遍的转录ITH。通过上皮可塑性实现的谱系多样化，即向分化程度较低状态的转变和转分化，构成了肺癌早期ITH的一个关键维度。我们进一步揭示，分化程度降低是恶性转化的特征性标志，并预测预后不良。值得注意的是，我们在AT2向AT1转分化过程中发现了一个独特的过渡状态，该状态具有激活的肿瘤抑制通路/基因。对scRNA-seq、CUT&Tag和bulk RNA-seq的整合分析显示，KLF4和JDP2是将LUAD重编程为过渡状态并抑制进展的关键转录因子。这些发现阐明了早期癌症中的ITH机制，并提出了靶向上皮可塑性的疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 早期肺腺癌中是否存在瘤内转录异质性，以及其起源机制是什么？
- 核心机制
- 肿瘤细胞通过上皮可塑性，即向分化程度较低状态转变和AT2-to-AT1转分化，驱动早期LUAD的瘤内异质性；KLF4和JDP2是重编程肿瘤细胞进入过渡状态并抑制进展的关键转录因子。
- 主要证据
- 对14例早期LUAD患者样本进行scRNA-seq和空间转录组分析，结合公共数据集和小鼠模型验证，发现肿瘤细胞向低分化状态转变和转分化产生异质性；KLF4/JDP2过表达在A549和H1437细胞中抑制增殖和迁移，并在A549移植瘤模型中抑制肿瘤生长；CUT&Tag和RNA-seq证实KLF4/JDP2直接调控过渡状态标记基因。
- 研究意义
- 阐明了早期癌症中ITH的机制，并提出了靶向上皮可塑性的治疗策略，KLF4/JDP2调控轴有望用于诱导肿瘤细胞重编程。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤细胞分化程度与疾病进展关联分析
探究肿瘤细胞分化状态是否随LUAD进展而改变
整合健康肺组织、早期、晚期和转移性LUAD的scRNA-seq数据，利用HCL数据库推断细胞谱系，计算AT1/AT2特征评分，构建拟时序轨迹，并在小鼠模型和TCGA/GSE72094队列中验证。
早期LUAD瘤内转录异质性表征
验证早期LUAD存在转录异质性并定义肿瘤细胞亚群
对肿瘤细胞进行PCA和無監督聚类，分为4个亚群（C1-C4），通过GSEA和NMF定义亚群功能；对2例早期LUAD进行空间转录组（Stereo-seq）验证亚群的空间分布；分析CNV与转录聚类的关系。
上皮可塑性驱动ITH的机制验证
验证肿瘤细胞通过低分化状态和转分化驱动ITH
利用HCL注释和AT1/AT2评分分析各肿瘤亚群的谱系特征，拟时序和RNA velocity分析C2亚群为AT2-to-AT1过渡态；在小鼠LUAD模型中验证分化丢失与转录多样性的相关性；鉴定C2过渡态标记基因。
肿瘤亚群C1和C3的功能及临床意义分析
探究C1和C3亚群的生物学功能及预后价值
比较C1和C3在MIA和IA中的比例变化，在独立数据集中验证；通过DEG分析鉴定C1标记CRABP2和C3标记LAMP3；GO和CellChat分析揭示C1为增殖状态、C3为免疫活跃状态；空间距离分析验证C1与免疫细胞的空间分隔；在TCGA和GSE72094队列中进行生存分析。
KLF4/JDP2调控过渡状态的分子机制解析
鉴定调控C2过渡状态的关键转录因子及其功能
通过SCENIC和iRegulon分析鉴定KLF4和JDP2为C2亚群的关键转录因子；免疫荧光验证KLF4与CLDN4共表达；CUT&Tag和RNA-seq分析KLF4/JDP2的直接靶基因和重编程效应。
KLF4/JDP2过表达的功能验证
验证KLF4/JDP2过表达对LUAD细胞增殖、迁移和体内肿瘤生长的影响
在A549和NCI-H1437细胞中通过慢病毒过表达KLF4或JDP2，进行细胞活力、克隆形成、软琼脂和Transwell实验；在A549皮下移植瘤裸鼠模型中验证KLF4过表达对肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | I型胶原酶 | -- | -- |
| IV型胶原酶 | -- | -- | |
| scRNA-seq文库构建 | 10x Genomics Chromium | 10x Genomics | -- |
| 空间转录组 | 核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | Q10212 |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7000 | |
| 核酸外切酶I | New England Biolabs | M0293L | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | SH30027.01 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 慢病毒包装 | pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达载体 | System Biosciences | CD510B-1 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| HiScript III第一链cDNA合成试剂盒（含gDNA清除） | ABclonal | RK20400 | |
| ChamQUniversal SYBR qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测 | Promega | G7573 |
| BioTek Gen5酶标仪 | BioTek | H1210-018 | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫溶液 | Sangon Biotechnology | E607309-0100 |
| 软琼脂实验 | 琼脂 | BD DIFCO | 214220 |
| 甲基噻唑四唑 | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| CUT&Tag | NovoNGS CUT&Tag 4.0高灵敏试剂盒 | Novoprotein | N259-YH01-01A |
| 抗Flag抗体 | Abmart | M20008 | |
| 抗小鼠免疫球蛋白G抗体 | Novoprotein | N270 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本与scRNA-seq | 样本例数（6 MIA，6 IA用于scRNA-seq；另2例用于空间转录组）、患者未接受新辅助治疗、肿瘤大小<3 cm、细胞质控标准 阅读提示：Materials and Methods中“Patient samples and clinical information”和“ScRNA-seq library preparation and sequencing”以及Fig. 1A |
| 肿瘤细胞鉴定 | inferCNV参数、CNV评分阈值、K-means聚类确定的恶性细胞群（K1、K3-K6） 阅读提示：Materials and Methods中“Inference of copy number and identification of cancer cells”及Fig. 1F-G |
| 细胞系功能实验 | 细胞系来源（A549 ATCC CCL-185，NCI-H1437 ATCC CRL-5872）、慢病毒载体和滴度、感染复数、筛选条件 阅读提示：Materials and Methods中“Cell culture”和“Plasmid constructs and lentivirus production” |
| KLF4/JDP2过表达功能实验 | 细胞接种密度（A549 1000/孔活力，600/孔克隆，10000/孔软琼脂，50000/孔迁移；H1437 2000/孔活力，800/孔克隆，10000/孔软琼脂）、检测时间点、重复数（三次重复） 阅读提示：Materials and Methods中“Cell viability assay”、“Colony formation assay”、“Soft agar assay”和“Cell migration assay” |
| 移植瘤实验 | 小鼠品系（6周龄雌性BALB/c裸鼠）、细胞接种量（2×10^6 A549细胞）、注射部位（皮下）、观察时间（4-5周）、测量频率（每3天）、肿瘤体积计算公式、伦理允许最大肿瘤直径（2.0 cm） 阅读提示：Materials and Methods中“Xenograft tumor model” |