Ccn1表达模式与条件敲除小鼠构建
确认Ccn1在NSPCs中的表达特异性并建立CNS特异性敲除模型。
免疫组化、免疫荧光和RNA原位杂交检测Ccn1在E13.5-P2脑内的表达；构建Nestin-Cre/Ccn1flox/flox小鼠，PCR鉴定基因型。
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空间转录组学揭示CCN1通过区域特异性细胞互作调控小胶质细胞分布的作用
Spatial transcriptomics revealed the regulatory role of CCN1 to microglia distribution through region-specific cellular interactions.
实验完整度
高包含scRNA-seq、空间转录组、免疫荧光、FACS、WB、qPCR、ISS等多层级验证，涵盖体外与体内模型。
主要模型
Nestin-Cre/Ccn1flox/flox条件敲除小鼠 Tmem119-tdTomato小胶质细胞报告小鼠 E17.5和P2小鼠前脑组织单细胞与空间转录组
重点核对
Nestin-Cre/Ccn1flox/flox小鼠在E17.5和P2脑内Ccn1表达经scRNA-seq和免疫荧光验证敲除效率 FACS分析tdTomato标记小胶质细胞比例（n=6只/组） IBA1免疫荧光定量VZ和LSR区域小胶质细胞数量（n=3-6只/组） 空间转录组Stereo-seq鉴定12个空间簇并比较WT与CKO区域分布 NicheNet预测NSPC-小胶质细胞配体-受体互作及ISS验证Spp1、Csf1r等表达
摘要
在脑发育过程中，神经干祖细胞（NSPCs）与小胶质细胞在精确的空间微环境中相互作用；然而，利用传统分析技术解析其机制充满挑战。本文中，我们利用中枢神经系统特异性Ccn1敲除小鼠，研究了富集于NSPCs的分泌蛋白CCN1的作用。通过单细胞RNA测序分析，我们发现Ccn1-CKO小鼠在E17.5和P2时心室区（VZ）的小胶质细胞显著减少，同时自噬和激活相关基因表达升高。P2时的空间转录组学进一步显示，Ccn1缺失导致小胶质细胞区域特异性重分布，并导致吻侧外侧隔区（LSR）小胶质细胞聚集和激活增加，同时VZ减少。机制上，NSCs中Ccn1缺失导致关键信号配体Csf1和Il2的区域特异性失调。我们发现Csf1和Il2的表达升高特异性地出现在LSR区域，这与其在LSR小胶质细胞中相应受体（Csf1r、Cd53）和下游靶点（Spp1、Ctsb）的上调相对应，影响小胶质细胞状态。我们的研究揭示了由Ccn1调控的区域特异性NSC–小胶质细胞相互作用，为理解脑发育中的多细胞动力学提供了新范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ccn1在脑发育过程中如何调控NSPC与小胶质细胞之间的相互作用及小胶质细胞的空间分布和状态。
- 核心机制
- NSCs中Ccn1缺失导致Csf1在VZ下调、LSR上调，Il2在NSCs中广泛上调，通过Csf1–Csf1r和Il2–Cd53轴改变小胶质细胞迁移和激活状态。
- 主要证据
- scRNA-seq显示CKO小胶质细胞比例降低且自噬/激活基因上调；空间转录组和免疫荧光证实小胶质细胞在VZ减少、LSR增加；NicheNet和ISS验证Csf1/Il2及其受体/靶基因的区域特异性表达变化。
- 研究意义
- 揭示了Ccn1作为NSC–小胶质细胞相互作用的区域特异性调控因子，为理解脑发育中多细胞动力学和空间微环境稳态提供了新范式。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小胶质细胞数量与分布的表型分析
验证Ccn1敲除对小胶质细胞数量和空间分布的影响。
scRNA-seq分析E17.5和P2前脑细胞组成；FACS定量tdTomato标记小胶质细胞比例；IBA1免疫荧光定量VZ区域小胶质细胞。
小胶质细胞转录状态分析
解析Ccn1敲除后小胶质细胞的转录组变化及激活/自噬状态。
scRNA-seq差异表达分析、GO富集、GSEA；免疫荧光共染IBA1/CTSB；Western blot检测LC3II/LC3I；TUNEL和Annexin-V-FITC流式检测凋亡；RT-qPCR检测Cd86和Ms4a6d。
空间转录组解析区域特异性分布
利用空间转录组揭示小胶质细胞在VZ和LSR区域的分布及基因表达差异。
P2 WT和CKO脑冠状切片Stereo-seq建库测序；STAGATE聚类注释空间域；比较VZ和LSR区域小胶质细胞比例及基因模块表达；IBA1免疫荧光验证。
配体-受体互作预测与验证
鉴定介导NSC–小胶质细胞互作的关键配体-受体对。
NicheNet分析空间转录组数据预测NSPC到小胶质细胞的配体-受体-靶基因网络；分析Csf1、Il2及其受体/靶基因在VZ和LSR的区域表达；ISS验证Csf1r、Spp1等表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | IBA1抗体 | Santa Cruz | sc-393770 |
| CTSB抗体 | CST | 31718T | |
| LC3抗体 | CST | 4108 | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-IG |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| RNA荧光原位杂交 | SEERNA® ISH RNA荧光原位检测试剂盒 | Dynamic Biosystems | -- |
| SlowFade Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 空间转录组 | STOmics Stereo-seq试剂盒 | BGI (STOmics Tech) | 101KL114 |
| KAPA DNA纯化磁珠 | KAPA | -- | |
| MGISEQ-2000RS测序仪 | BGI | -- | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| FACS | MoFlo XDP细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
| 成像 | Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 原位测序成像 | 3D-Hitech Pannoramic®MIDI II扫描仪 | 3D-Hitech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小胶质细胞比例FACS分析 | 小鼠基因型（tdTomato-WT vs tdTomato-CKO）、每组n=6只、E17.5和P2时间点、流式设门策略 阅读提示：Methods 'FACS analysis'与Figure 1I图注 |
| VZ和LSR区域小胶质细胞免疫荧光定量 | IBA1抗体稀释比（文中未明确说明）、每组n=6（E17.5/P2）或n=3（P2验证）、区域划分标准 阅读提示：Methods 'Tissue processing, immunostaining, and imaging'与Figure 1J-K、Figure 3F-G图注 |
| 空间转录组Stereo-seq | 切片厚度10 μm、STOmics Stereo-seq kit（101KL114）、测序平台MGISEQ-2000RS、数据分析流程SAW v6.0.0和STAGATE参数 阅读提示：Methods 'Spatial transcriptomics library preparation'和'Spatial transcriptomics analysis' |
| NicheNet配体-受体互作预测 | 配体-受体网络数据库版本、niche定义（LSR vs VZ）、top配体数量（50）、minLFC计算方式 阅读提示：Methods 'Spatial transcriptomics analysis'中NicheNet段落 |
| 原位测序（ISS）验证 | 探针设计（Csf1、Il2、Csf1r、Cd53、Spp1）、测序轮次、图像配准算法（SIFI）、解码阈值 阅读提示：Methods 'In situ sequencing (ISS)'与Figure 4L-M、Figure S6F-H图注 |