构建人类胎儿心脏多组学图谱
建立覆盖第一和第二孕期的整倍体人类心脏单细胞、染色质可及性和空间转录组图谱。
对4–20 PCW整倍体胎儿心脏进行scRNA-seq、配对snRNA-seq与snATAC–seq（Multiome，10x Genomics）及空间转录组（Visium SD、Visium HD、Xenium），质控后整合细胞和细胞核注释。
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人类心脏发育动态及其在21三体中的紊乱
Dynamics of human cardiogenesis and its disruption in trisomy 21
实验完整度
高整合单细胞/snRNA-seq、snATAC–seq、Visium SD/HD、Xenium空间数据，并含人T21与同基因iPS细胞及Dp1Tyb小鼠体内功能验证
主要模型
4–20 PCW整倍体人类胎儿心脏组织 11–14 PCW 21三体人类胎儿心脏组织 同基因匹配T21与整倍体人iPS细胞来源心肌细胞 Dp1Tyb唐氏综合征小鼠模型
重点核对
整倍体胎儿心脏样本：26例，覆盖4–20 PCW；T21样本：11例，覆盖11–14 PCW scRNA-seq/snRNA-seq与Multiome质控后保留297,473个细胞和细胞核；ATAC质控后167,022个细胞核（11颗心脏） 空间数据：10颗心脏的32个捕获区域，含Visium SD 55 μm、Visium HD 2 μm和Xenium T21与年龄匹配整倍体比较使用scVI整合及Milo邻域差异丰度分析（spatial FDR < 0.1） iPS细胞TUNEL凋亡检测：每种基因型n = 5次独立分化，二项回归含分化批次
摘要
发育动态涉及多种细胞类型的特化及其空间组织形成多细胞微环境。本文结合单细胞与空间多组学，在发育中的心脏中定义了21个不同的组织微环境，并据此开发了一种情境感知、与分辨率无关的微环境分类工具（TissueTypist）。将高分辨率空间图谱应用于发育中的窦房结，解析出沿线性轴排列的三种起搏细胞亚型。第一孕期亚群，如窦角起搏细胞和窦房结头部区域起搏细胞，显示神经吸引程序，并通过包括Eph–ephrin和semaphorin–plexin信号在内的相互作用与副交感神经元相互作用。时间轨迹描绘了心房和心室心肌细胞的成熟过程，并揭示了脂质–代谢转换及细胞类型身份的潜在关键调控因子。在心室中，我们识别出沿伪时间和透壁轴的细胞及转录梯度，为心肌致密化和成熟提供分子见解。比较分析显示，与整倍体心脏相比，21三体心脏的致密心肌细胞减少且凋亡增加。这一发现在使用诱导多能干细胞衍生的同基因匹配21三体与整倍体心肌细胞中得到验证。这些早期发育扰动可能促成了唐氏综合征相关先天性心脏病风险增加。总之，我们提出了一个空间分辨的人类心脏发育框架，可用于系统探索健康与疾病中的发育微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类心脏发育中细胞如何组织为多细胞微环境，以及21三体在早期心脏发育中造成哪些细胞和空间扰动。
- 核心机制
- 第一孕期窦角及窦房结头部起搏细胞表达神经吸引程序（SLIT–ROBO、semaphorin、ephrin等）招募副交感神经元；21三体心脏中致密心室心肌细胞减少，伴随心肌生成、氧化磷酸化和缺氧反应通路紊乱及凋亡相关程序上调，同基因T21 iPS细胞心肌细胞凋亡增加。
- 主要证据
- 单细胞与空间多组学定义21个组织微环境并解析窦房结起搏细胞亚型；T21与整倍体心脏比较显示致密心肌细胞比例下降；Dp1Tyb小鼠HREM显示E15.5致密心肌层变薄；同基因T21 iPS细胞来源心肌细胞TUNEL显示凋亡细胞比例增加。
- 研究意义
- 提供人类心脏发育的空间分辨框架和微环境注释工具，并为理解唐氏综合征相关先天性心脏病的早期发育扰动提供资源；作者指出这些分子和细胞变化可能增加CHD风险，而非证明其导致室间隔缺损。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间映射心脏细胞类型并定义微环境
将单细胞定义的细胞类型映射到空间位置，识别多细胞组织微环境并与组织学对照。
Visium SD采用cell2location反卷积；Visium HD采用bin2cell聚合2 μm bin并用TACCO进行参考组成注释；Xenium采用形态学分割和TACCO；Visium HD用CellCharter识别19个微环境，Visium SD用Leiden聚类定义18个微环境，整合为7个粗粒度、21个细粒度微环境层级。
开发并验证TissueTypist微环境分类器
建立可跨空间分辨率和平台转移微环境注释的分类工具。
用逻辑回归整合自身基因表达、邻域表达和到组织边缘距离，训练粗粒度7类与细粒度21类层级模型，并在留一切片交叉验证、MERFISH、Xenium及人肺Visium数据中评估。
解析窦房结起搏细胞亚型与神经微环境
确定窦房结起搏细胞亚型的空间组织及其与副交感神经元的相互作用。
在Visium HD数据中鉴定约3,300个起搏细胞并分为窦角、窦房结头部和尾部亚群；构建跨窦房结轴，分析邻近细胞富集、H&E和DAPI空间邻近性，并用CellPhoneDB分析配体–受体互作。
描绘心房和心室心肌细胞成熟轨迹
解析心房和心室心肌细胞的成熟、空间梯度及关键转录调控因子。
用MultiVI整合RNA和ATAC数据，scFates和Palantir构建伪时间轨迹，SCENIC+推断基因调控网络，CellOracle进行计算机模拟TF扰动；用OrganAxis定义左心室透壁轴并分析细胞丰度和基因梯度。
验证PRDM16对心肌细胞成熟的作用
评估PRDM16诱导对心肌细胞成熟相关转录程序的影响。
在RUES2人胚胎干细胞中建立多西环素诱导PRDM16–mCherry（Tet-ON）系统，分化心肌细胞后比较+Dox与–Dox的bulk RNA-seq成熟评分及差异表达。
比较21三体与整倍体心脏并验证表型
确定21三体对心室致密化的影响及凋亡变化。
生成11–14 PCW T21心脏multiome和Visium数据，与年龄匹配整倍体整合，使用Milo和edgeR/GSEA分析；用Dp1Tyb小鼠E15.5 HREM量化致密心肌比例，用E13.5小鼠scRNA-seq比较；用同基因T21与整倍体iPS细胞来源心肌细胞TUNEL检测凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建单细胞与空间多组学图谱
空间细胞类型映射与微环境分析
体内结构表型评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞核分离 | 玻璃Dounce组织研磨器 | Merck | -- |
| 40微米细胞筛 | Corning | -- | |
| 7-AAD活力染色液 | BioLegend | -- | |
| 20微米细胞筛 | CellTrics | -- | |
| 单细胞核分选 | MA900多应用细胞分选仪 | Sony | -- |
| 单细胞核分离 | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Multiome ATAC+基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 空间转录组切片区 | Leica CX3050S冷冻切片机 | Leica | -- |
| Leica RM2125RT切片机 | Leica | -- | |
| FFPE组织处理 | Tissue-Tek真空浸润处理器5 | Sakura Finetek | -- |
| RNA完整性检测 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 空间转录组 | CytAssist FFPE Visium空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| FF Visium空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Visium文库制备试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| 组织成像 | Hamamatsu NanoZoomer S60扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| Visium HD组织成像 | VS200显微镜 | Olympus | -- |
| Xenium | Xenium Prime-5K人类泛组织与通路探针面板 | 10x Genomics | -- |
| 小鼠HREM | 高分辨率表面显微成像 | -- | -- |
| 小鼠HREM图像处理 | Fiji图像处理软件 | -- | -- |
| 小鼠单细胞解离 | 新生心脏解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| gentleMACS Octo组织解离仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 40微米FLowmi细胞筛 | -- | -- | |
| 小鼠scRNA-seq | Chromium单细胞3′试剂盒 | 10x Genomics | CG000315 |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| iPS细胞培养 | Geltrex基质胶 | Thermo Scientific | -- |
| mTeSR1培养基 | Stemcell Technologies | -- | |
| Karyostat+核型检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PluriTest多能性检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 心肌细胞分化 | Y-27632 | Tocris | -- |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Scientific | -- | |
| B27-胰岛素添加剂 | Thermo Scientific | -- | |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | -- | |
| IWR-1 | Sigma | -- | |
| L-抗坏血酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 无葡萄糖/无谷氨酰胺DMEM | Thermo Scientific | -- | |
| 心肌细胞消化 | 心肌细胞解离试剂盒 | Stemcell Technologies | -- |
| TUNEL与免疫荧光 | 96孔成像板 | Greiner Bio-One | -- |
| Click-iT Plus TUNEL检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Invitrogen | MA5-12960 |
| 驴抗小鼠-568二抗 | Invitrogen | A10037 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 高内涵成像 | Operetta CLS高内涵分析系统 | PerkinElmer | -- |
| PRDM16质粒构建 | PB-HS4-DOX-T2A-mCherry-bGHpA-HS4-EF1a-TetO-T2A-Puro-HS4载体 | -- | -- |
| In-Fusion Snap Assembly预混液 | Takara | 638948 | |
| CloneAmp高保真酶 | Takara | 639298 | |
| Monarch胶回收试剂盒 | NEB | T1120 | |
| NEB Stable感受态大肠杆菌 | NEB | C3040H | |
| QIAprep Spin Miniprep试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| iPS细胞转染 | Matrigel基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR 1基础培养基 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| RevitaCell添加剂 | Fisher | 15317447 | |
| Super piggyBac转座酶表达载体 | Stratech | PB210PA-1-SBI | |
| Lipofectamine Stem转染试剂 | Life Technologies | STEM00003 | |
| PRDM16诱导 | 盐酸多西环素 | Sigma | D9891 |
| RNA保存 | RNA保存–裂解缓冲液 | Zymo | -- |
| bulk RNA-seq | Plasmidsaurus测序服务 | Plasmidsaurus | -- |
| 单分子FISH | RNAscope多重荧光试剂盒v.2 | Advanced Cell Diagnostics, Bio-Techne | -- |
| Leica BOND RX自动染色仪 | Leica | -- | |
| Opal 520荧光染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 650荧光染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| TSA Plus生物素试剂盒 | Akoya | -- | |
| 链霉亲和素偶联Atto 425 | Sigma Aldrich | -- | |
| 单分子FISH成像 | Perkin Elmer Opera Phenix高内涵筛选系统 | Perkin Elmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学图谱样本与测序 | 样本来源与伦理批号、供体孕周分布、单细胞核分选门控、测序深度（每个细胞核至少20,000–30,000 read pairs） 阅读提示：Methods中Human embryonic and fetal heart tissues与Sample collection and processing；Supplementary Table 1–2 |
| 空间转录组平台与质控 | Visium SD 55 μm、Visium HD 2 μm、Xenium的切片厚度、FF/FFPE处理、透化时间（FF 45 min）、UMI和基因数过滤阈值 阅读提示：Methods中Spatial transcriptomic processing、Preprocessing and quality control及Cell segmentation and cell-type annotation |
| 微环境定义与TissueTypist训练 | CellCharter空间层与k参数、cell2location每个spot平均细胞核数（n = 20）、TissueTypist训练权重（邻域0.3、边缘距离5.0）、LOSO折数 阅读提示：Methods中Cellular niche prediction and annotation、TissueTypist及Extended Data Fig. 5 |
| T21与整倍体比较 | T21样本孕周11–14 PCW、整倍体匹配孕周12–14 PCW、供体数、Milo spatial FDR阈值、scVI协变量 阅读提示：Methods中T21 single-nucleus multiome analysis及Fig. 5、Extended Data Fig. 8 |
| 小鼠致密心肌量化 | Dp1Tyb遗传背景与品系编号、E15.5取样、HREM体素分辨率2.5 μm、每颗心脏11个测量平面、盲法分割 阅读提示：Methods中Mouse compact myocardium analysis及Fig. 5e、Extended Data Fig. 8c–e |
| iPS细胞来源心肌细胞凋亡检测 | WC-24-02-DS-M与WC-24-02-DS-B细胞系、分化方案、TUNEL检测时间day 30–35、每种基因型n = 5次独立分化、心肌肌钙蛋白T阈值 阅读提示：Methods中Detection of apoptosis in iPS-cell-derived cardiomyocytes及Fig. 5g |
| PRDM16诱导实验 | RUES2 Tet-ON系统、多西环素1 μM从day 27开始、day 37收集、每组4个技术重复、236基因成熟评分 阅读提示：Methods中TF overexpression in iPS-cell-derived cardiomyocytes及Extended Data Fig. 7k–n |