CD169+巨噬细胞清除对CAC和CT26肿瘤的影响
验证CD169+巨噬细胞在炎症驱动肿瘤发生及非结肠炎肿瘤模型中的作用。
在AOM/DSS诱导的CAC模型和CT26皮下肿瘤模型中，使用CD169-DTR小鼠结合DT清除CD169+细胞，检测体重、结肠肿瘤数目、组织病理、肿瘤生长和瘤内T细胞浸润。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CD169巨噬细胞状态的阶段相关重塑与结肠炎相关结直肠癌免疫调节相关
Stage-associated remodeling of CD169 macrophage states is linked to immune regulation in colitis-associated colorectal cancer
实验完整度
高包含AOM/DSS和CT26小鼠模型、scRNA-seq、基因清除、体外共培养及人CAC标本验证，具备功能与机制验证。
主要模型
AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型 CT26皮下肿瘤小鼠模型 CD169-DTR小鼠 人结肠炎相关结直肠癌标本
重点核对
AOM/DSS模型：AOM 10 mg/kg单次腹腔注射，DSS 2–2.5%饮水5天，14天常规水，共3循环 CD169+巨噬细胞清除：DT 25 ng/g体重腹腔注射，隔天一次，DSS前1天开始持续全程 CT26模型：5×10^5个CT26细胞皮下注射至BALB/c背景CD169-DTR小鼠右胁腹 C3G体内给药：4 μM，200 μL/只腹腔注射，每2天一次，共7天（免疫组成分析） 流式细胞术设门：活细胞、CD45+、CD11b+、CD169+依次设门，7-AAD排除死细胞
摘要
背景：结肠炎相关结直肠癌（CAC）由慢性炎症和免疫失调驱动。然而，CAC进展不同阶段巨噬细胞状态异质性如何组织仍不清楚。方法：我们利用基因敲除、单细胞转录组学、药理学干预以及人结肠炎相关结直肠癌标本分析，鉴定CAC进展过程中CD169相关巨噬细胞状态的阶段相关重塑。结果：我们发现CD169标记功能不同的巨噬细胞状态，具有相反作用：CD169低表达巨噬细胞在结肠炎期间占主导并表现出促炎特征，而CD169中/高表达巨噬细胞出现在肿瘤阶段，优先定位于瘤旁区域，并显示免疫抑制和免疫惰性相互作用谱。这些观察支持CAC进展过程中CD169相关巨噬细胞状态的阶段相关重塑。重要的是，CD169清除抑制肿瘤生长并增强瘤内T细胞浸润，突显CD169相关巨噬细胞作为炎症驱动结直肠肿瘤发生的潜在治疗靶点。结论：总之，我们的发现揭示CAC进展过程中CD169相关巨噬细胞状态的阶段相关重塑，不同CD169状态在不同疾病阶段表现出不同的免疫调节特征。这些发现强调在靶向CD169相关通路时考虑巨噬细胞状态异质性的重要性，并支持进一步研究炎症驱动结直肠肿瘤发生中基于状态的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAC进展过程中CD169相关巨噬细胞状态如何随疾病阶段重塑，及其在免疫调节中的作用。
- 核心机制
- CD169标记功能不同的巨噬细胞状态，CD169低表达促炎状态主导结肠炎阶段，CD169中/高表达免疫抑制状态在肿瘤阶段富集于瘤旁区域；CD169+巨噬细胞可能通过APP–CD74信号促进免疫抑制性巨噬细胞重编程。
- 主要证据
- AOM/DSS CAC模型和CT26模型中CD169+巨噬细胞清除抑制肿瘤生长并增加CD4+、CD8+ T细胞浸润；scRNA-seq鉴定五个巨噬细胞亚群及CD169相关状态；人CAC标本IHC、流式和qPCR验证瘤旁CD169+细胞富集；体外transwell共培养显示CD169+巨噬细胞经APP–CD74诱导CD169−巨噬细胞表达Tgfb1、Arg1和Il10。
- 研究意义
- 揭示CD169相关巨噬细胞状态的阶段相关异质性，为炎症驱动结直肠肿瘤发生中靶向CD169相关通路提供依据，并提示C3G等药理干预的潜在研究方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CAC进展各阶段免疫细胞单细胞转录组图谱
在单细胞分辨率表征CAC进展中CD169表达免疫群体及巨噬细胞异质性。
FACS分选正常结肠、结肠炎、瘤旁和肿瘤组织的CD45+免疫细胞，进行10× Genomics scRNA-seq，聚类注释并分析Siglec1表达。
巨噬细胞亚群鉴定及CD169相关状态定义
解析巨噬细胞异质性并定义CD169高、中、低表达状态。
从整合单细胞数据提取巨噬细胞重新聚类，鉴定C1–C5亚群，依据Siglec1平均归一化表达排序注释CD169-low（C2）、CD169-mid（C1）、CD169-high（C3），并行差异表达、PCA、GO和上游调控分析。
CD169相关状态的时空分布及人源验证
验证CD169相关巨噬细胞状态在疾病阶段和空间区域上的分布。
利用伪时间轨迹分析、各阶段亚群比例分析，并在人CAC配对瘤旁和肿瘤组织中进行CD169免疫组化、流式和qPCR验证。
CD169中/高表达巨噬细胞免疫抑制相互作用及APP–CD74机制验证
探究CD169中/高表达巨噬细胞与免疫细胞的相互作用及免疫抑制功能。
CellPhoneDB分析细胞间通讯，体外分选瘤旁CD11b+CD169+和CD11b+CD169−巨噬细胞进行transwell共培养，并用抗APP或抗CD74阻断，qPCR检测Tgfb1、Arg1、Il10。
C3G药理干预对CD169表达及肿瘤进展的影响
评估C3G靶向CD169相关通路对CAC和CT26肿瘤的治疗效果。
在AOM/DSS CAC模型和CT26皮下模型中给予C3G，检测结肠长度、肿瘤数目、病理、CD169表达、瘤内T细胞及免疫细胞组成；并进行DSS结肠炎中DT与C3G联合实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫抑制功能与机制
评估体外肿瘤细胞表型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AOM/DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | -- | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- | |
| CD169+细胞清除 | 白喉毒素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫组化 | 抗CD169一抗 | Abcam | -- |
| 免疫荧光 | 抗CD169一抗 | -- | -- |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | ReverTra Ace® qPCR逆转录试剂盒 | TOYOBO | -- |
| 实时定量PCR | THUNDERBIRD® SYBR® qPCR预混液 | TOYOBO | -- |
| QuantStudio™ 6 Flex实时PCR系统 | -- | -- | |
| 流式细胞分选 | FACS Aria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 单细胞RNA测序 | 10× Genomics Chromium平台 | 10× Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| 共聚焦成像 | LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AOM/DSS诱导CAC模型 | AOM剂量10 mg/kg单次腹腔注射；DSS浓度2–2.5%饮水5天，间隔14天常规水，共3循环；终点时间点day 0、9、30、60、80 阅读提示：Materials and methods中“AOM/DSS-induced colitis-associated colorectal cancer model”小节及Fig. 1A、C |
| CD169+巨噬细胞清除 | DT剂量25 ng/g体重，隔天腹腔注射，DSS前1天开始持续全程；CD169-DTR小鼠背景（C57BL/6J用于CAC，BALB/c用于CT26） 阅读提示：Materials and methods中“Diphtheria toxin-mediated depletion of CD169+ macrophages”小节及Fig. 1G |
| CT26皮下肿瘤模型 | CT26细胞5×10^5皮下注射至BALB/c背景CD169-DTR小鼠右胁腹；肿瘤体积计算公式(length×width^2)/2；每2–3天测量 阅读提示：Materials and methods中“CT26 subcutaneous tumor model”小节 |
| C3G体内给药 | C3G剂量4 μM，200 μL/只腹腔注射，每2天一次共7天（免疫组成分析）；CAC模型中给药剂量和日程文中未明确说明（仅描述“indicated dose and schedule”） 阅读提示：Materials and methods中“C3G treatment”和“Flow cytometric analysis of immune composition following C3G treatment”小节；Figure S5A |
| 体外transwell共培养及阻断 | CD11b+CD169+巨噬细胞接种上室，CD11b+CD169−巨噬细胞接种下室；0.4-μm insert；共培养48小时；抗APP中和抗体或抗CD74阻断抗体处理浓度文中未明确说明 阅读提示：Materials and methods中“Macrophage isolation and transwell co-culture assay”小节及Figure S4A |
| 人CAC标本验证 | 配对瘤旁和肿瘤标本n=9；IHC每样本2张切片，每张5个高倍视野；瘤旁定义为病理确认的紧邻肿瘤的非肿瘤组织 阅读提示：Materials and methods中“Human tissue validation analyses”小节及Fig. 4F–I、Figure S3 |